陈 丽综述，何晓英审校

（泸州医学院附属医院神经内科，四川泸州646000）

凝血酶在脑卒中保护作用的研究进展

陈 丽综述，何晓英审校

（泸州医学院附属医院神经内科，四川泸州646000）

凝血酶；卒中；神经再生；脑/血液供给；综述

脑卒中是一组突然起病，是以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病，包括脑出血、脑梗死及蛛网膜下脑出血。中国脑卒中发病率排名世界第一，比美国高1倍，脑卒中已成为中国第1位死因。脑卒中除了高致死率外，还具有高致残率，全国存活的脑卒中患者中有3/4患有不同程度的残疾，且呈年轻化趋势，使正值盛年的残疾人给家庭和社会带来了巨大的经济负担和社会问题。但是脑卒中病理机制复杂，治疗效果仍不容乐观，积极寻找有效措施减轻脑卒中造成的神经功能缺失、降致残率，是当前神经科学研究的重要课题。

1 凝血酶结构

人体凝血酶由轻链A和重链B构成，其中A链主要作用是稳定凝血酶的整体结构。B链结构相对复杂，主要包括以下3个位点。（1）精氨酸侧链口袋：催化位点，主要由Asp102、His47和Set195构成；（2）非极性结合位点：可与底物发生疏水作用；（3）阴离子结合位点：由B链中的6个Lys构成，包括：LysB21、B52、B65、B106、B107、B154，可与血小板受体相互作用，另外B链内有3个二硫键（Cys42-Cys58、Cys168-Cys182、Cys191-Cys220），具有稳定凝血酶结构的作用。

2 凝血酶生物特性

不管是正常生理还是在病理状态下，凝血酶都发挥着重要的作用[1]。主要包括：（1）激活凝血因子，促进血小板聚集及加快纤维蛋白的形成；（2）趋化并促进炎性细胞到达损伤部位及分泌炎症介质，增强NK细胞的溶解及杀伤能力；（3）增强内皮细胞合成能力，加快细胞因子释放及血管的通透性；（4）促进平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、单核细胞的增殖；（5）可调节神经起源细胞的生长分化及死亡、血管新生、神经保护、影响疼痛信号的传递、骨的形成。

3 凝血酶受体（TR）

TR经水解后生成蛋白酶活化受体（PARs），由425个氨基酸构成，为经典的7次穿膜G蛋白偶联受体，与凝血酶结合后可切断PAR胞外N-端Arg41-Ser42间的肽键，激活G蛋白，从而将信号传到细胞内，引起细胞变化。在中枢神经系统中，凝血酶受体活化后产生的细胞信号更为广泛，机制更加复杂。目前，已有4种PAR的cDNA被克隆，PAR1、PAR2、PAR3基因定位于5q13，PAR4基因定位于19p12。在神经系统以PAR1介导细胞信号作用最为显著[2]。脑卒中后TR被激活，细胞内物质具体包括肌醇1、三磷酸肌醇（IP3）、甘油二酯（DAG）、Ca2+、蛋白磷酸化、腺苷酸环化酶等发生改变，将细胞外信号传入细胞内，发挥神经保护甚至神经毒性作用[3]。

4 凝血酶在神经中枢的产生、作用特点及清除

脑出血后凝血酶的数量明显增加，主要由脑出血后血肿组织团块产生，此外也有一部分来自血液及受损伤的脑组织本身。凝血酶在中枢神经系统具有两面性，既可加重脑细胞水肿，导致细胞凋亡，又可提高神经细胞耐受能力，免受外界损伤，主要取决于受体的活化率和第二信号的清除之间的比例，低浓度（＜50 nmol/L）活化的凝血酶可不断失活，不断降解，使凝血酶还未发挥细胞毒性，就已经被消除。反之，高浓度（≥50 nmol/L）时将加重脑水肿、细胞凋亡、炎性反应及诱发癫痫等神经毒性作用。脑卒中后，受损伤的脑组织缺血、缺氧，新陈代谢减慢，加之脑脊液循环本身就较缓慢，故凝血酶在脑组织中的清除缓慢，其作用效应也将较其他部位延长。

5 凝血酶促进神经突触可塑性

神经细胞之间信息传递功能的特殊接触部位叫神经突触，与大脑的神经冲动、学习、记忆有密切关系。脑卒中后神经突触遭到破坏，凝血酶通过直接或间接激活PAR1，参加突触传递和可塑性恢复。Stein等[4]在急性脑缺血的C57BL/6小鼠中，测得细胞外LTP，指给突触前纤维一个短暂的高频刺激后，突触传递效率和强度增加几倍且能持续数小时至几天保持这种增强的现象）明显增强，且N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）也明显增多，且使用凝血酶抑制剂或PAR1抑制剂可阻碍上述物质的变化。Shimon等[5]在总结凝血酶可通过调节神经突触可塑性来影响神经功能恢复中，指出凝血酶调节神经突触是通过激活PAR1来完成的。Becker等[6]研究表明，在去神经的小鼠齿状颗粒细胞中，通过PAR1激活门冬氨酸受体使突触可塑性改变。具体机制如下：脑卒中后，凝血酶活性增强，激活PAR1，NMDA通道复合体激活，LTP增强，使突触传递效率增强，加快神经突触可塑性功能恢复，提高记忆及学习能力。

6 凝血酶促进神经细胞再生

神经元细胞属于永久性细胞，无再生能力，但Yang等[7]研究发现，存在于脑室下带、海马齿状回、成年哺乳动物的皮质内神经祖细胞存在再生的潜能，并通过实验证实凝血酶能促进DCX（神经元前体细胞移行过程中表达的一种微管结合蛋白），应用水蛭素后该物质明显减少。d′Audigier等[8]研究发现，在凝血酶及其受体可刺激内皮前体细胞的分化，促进内皮细胞增殖。Liu等[9]在脊髓损伤模型中，通过免疫印迹分析和免疫组织化学染色方法，证明Ras/Raf/ERK1/2（细胞外信号调节激酶）传导途径参加了神经细胞修复。Sayyah等[10]在人类1 321 n1胶质母细胞瘤细胞中，凝血酶可通过激活Rap1/β1整合素传导途径，激活下游RhoA介导和磷脂酶D，促进胶质母细胞瘤细胞增殖。凝血酶促进神经细胞再生可能机制：（1）凝血酶通过细胞外调节蛋白使Raf活化形成Ras-GTP，与激活的PKC和Raf共同激活ERK1/2，使细胞核内转录因子和（或）P70核蛋白体S6激酶数量增多，促进神经细胞再生。（2）血管内皮生长因子（VEGF）：脑神经细胞再生与血管再生紧密联系，VEGF为一种特异性内皮细胞丝裂原，凝血酶通过刺激细胞分泌VEGF，为神经细胞再生提供条件。

7 凝血酶促进脑血管再生

血管新生主要指在原有的毛细血管与微静脉基础上通过血管内皮细胞的增殖和迁移，从先前存在的血管处以芽生或非芽生（或称套迭）的形式生成新的毛细血管，主要包括：血管生成因子释放，细胞外基质（ECM）降解，内皮细胞增殖、迁移和浸润；血管结构的修整、改建。Tsopanoglou等[11]在鸡尿囊绒膜（CAM）系统和基质胶系统证实凝血酶具有促进血管新生。主要通过两条途径促进血管新生：（1）凝血非依赖途径，通过调节细胞因子的表达，如缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、VEGF、促血管生成素-1（Ang-1）、Ang-2、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9等，促进血管新生；（2）凝血依赖途径，通过纤维蛋白产生，促进脑血管新生。

7.1 凝血非依赖途径

7.1.1 凝血酶与HIF-1α HIF-1α在缺血缺氧条件下增多，常氧条件下几乎不被检测到，但凝血酶在常氧条件下就能促进血管平滑肌细胞HIF-1α的表达[12]。凝血酶促进血管新生的可能机制是凝血酶受体活化后，通过增加HIF-1α蛋白的翻译或抑制蛋白降解，使细胞中的HIF-1α蛋白水平升高，也可调节HIF-1α的表达依赖G蛋白偶联受体（GPCRs）促进血管新生。

7.1.2 凝血酶与VEGF VEGF与其受体（VEGFR-1、VEGFR-2）在血管新生过程中有重要的作用。Wang等[13]将人类脐平滑肌细胞（HUASMC）暴露于凝血酶10 U/mL中，12 d后研究结果显示，凝血酶显著增加了HUASMC增殖（n=11，P=0.002）和 VEGF mRNA表达（n=4，P= 0.024）。凝血酶促进VEGF释放机制：凝血酶与其受体PAR结合活化细胞内p42/p44 MAPK，使转录因子SP1 Thr453和Thr739磷酸化，活化的SP1与活化蛋白-2（AP-2）形成转录因子复合体，结合于VEGF启动子（-88、-66）GC富含区，促进VEGF的转录，加快血管内皮细胞的形成。最近研究表明，血小板活化后，通过激活PAR1、PAR4，不仅可使VEGF增多促进血管新生，也能增加内皮抑素的释放抑制血管生成，但VEGF的释放占主导地位，从而促进血管生成[14]。

7.1.3 凝血酶与Ang-1、Ang-2 Ang-1和Ang-2调节血管形成，主要通过激活或阻碍内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体（Tie2）。凝血酶活化后仍可通过激活PAR1使Ang-2基因的转录增多，也可促进Ang-1诱导的内皮祖细胞迁移，促进血管生成。凝血因子Ⅹa可以通过不经典的途径激活PAR3受体，活化Tie2，调节血管生成及稳定血管的完整性[15]。

7.1.4 凝血酶与整合素 整合素αVβ3表达于血管内皮细胞，其表达被认为是内皮细胞血管生成的标志。凝血酶通过增加整合素αVβ3 mRNA转录和蛋白表达，使整合素αVβ3明显增多，加快内皮细胞的黏附、迁移、存活[16]。凝血酶的RGD序列起着不可替代的作用。

7.1.5 凝血酶与MMP MMP在体内主要作用是降解细胞外基质（ECM）。主要通过4个方面促进血管新生：（1）降解血管基底膜及周围的ECM，使血管新生的出芽和内皮细胞的迁移；（2）释放调控血管新生的细胞因子；（3）暴露ECM与integrin结合的位点；（4）分离细胞间的黏附。脑卒中后，凝血酶通过增加MMP-1、MMP-2的蛋白表达，使紧密联系的内皮细胞相互分离且分泌相关细胞因子，增强内皮细胞能力迁移。Machida等[17]发现，脑出血后凝血酶活化后通过PAR1受体使大脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞释放MMP9，其中以周细胞释放最多。

7.2 凝血依赖途径 此途径主要研究集中于肿瘤血管新生方面的研究，主要是通过凝血酶裂解纤维蛋白原进而形成纤维蛋白，也可诱导相关因子的释放，促进血管新生。

7.3 凝血酶与Na+/Ca2+交换体（NCX） Andrikopoulos等[18]发现，在人血管内皮细胞（HUVEC）中，NCX参与凝血酶促进血管新生过程。具体机制：凝血酶活性增强，通过NCX使胞质内Ca2+增多，NADPH氧化酶介导产生活性氧（ROS），进一步促进PAR1及ERK1/2的活化，使用抑制剂SEA0400或NCX1 siRNA均将使ERK1/2的磷酸化减弱，新生血管减少。

8 凝血酶提高神经元耐受能力

8.1 凝血酶提高神经元耐受能力主要表现 低浓度（50 pmol/L～50 nmol/L）凝血酶不仅不会损伤神经细胞，反而可增强神经细胞在低血糖、缺氧、缺血、外界损伤等情况下的耐受能力，使神经细胞存活，保证其正常功能。凝血酶还可以加快神经生长因子的合成及分泌，促进神经细胞损伤的修复，不仅如此，小剂量凝血酶预处理脑出血大鼠后可减轻之后较大剂量凝血酶引起的脑水肿。Wang等[19]将PAR1基因敲除后可明显加重脑水肿及神经元的死亡及行为障碍。激活内源性蛋白质C使用凝血酶突变W215A/E217A治疗缺血性卒中可以提高神经元的存活和减少脑梗死灶，与组织纤溶酶原激活物治疗脑梗死相比，可大大减少出血风险[20]。

8.2 凝血酶提高神经元耐受能力可能机制 （1）与凝血酶受体PAR1活化有关，预先激活PAR1，可刺激新蛋白质合成，并与凝血酶受体mRNA的3′端非翻译区结合，从而产生保护作用；（2）促进热休克蛋白（heatshock protein，HSP）激活，TPC通路信号转导途径，激活HSP 27，使脑细胞耐受性增加，减轻细胞肿胀及减少凋亡，从而保护神经元；（3）PAI-1增多，PAI-1属于体内凝血酶抑制物，凝血酶促进PAI-1 mRNA增加，及PAI-1蛋白水平的增加，减少由于脑卒中生成大量凝血酶毒性作用，从保护神经细胞免受损害。

近年来，凝血酶的脑保护作用已引起人们的广泛关注，但其具体机制仍在研究中，能否在凝血酶的神经毒性作用与神经保护作用找到平衡，是作者奋斗的目标。合理地调节凝血酶的水平，尽可能地减少脑损伤，加快脑康复提供理论依据，为临床治疗提供新的观念和思路。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.021

A

1009-5519（2015）16-2468-03

2015-05-04）

陈丽（1989-），女，重庆忠县人，硕士研究生，主要从事脑血管方向的研究；E-mail：1156506016@qq.com。

何晓英（E-mail：102050228@qq.com）。