李 伟

(天津市药品检验所，天津 300070)



睾酮凝胶微生物限度检查方法适用性试验的研究

李 伟

(天津市药品检验所，天津 300070)

目的：建立睾酮凝胶微生物限度检查方法，并进行方法适用性试验。方法：利用5%氯化钙溶液能与睾酮凝胶中的主要基质卡波姆结合形成钙盐沉淀达到破胶目的的原理，取本品10 g，加5%无菌氯化钙溶液30 ml，振摇，使凝胶基质破胶产生沉淀，加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，自然沉降5 min，取上部溶液进行薄膜过滤，冲洗后，取滤膜依法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数及控制菌检查。结果：可有效去除睾酮凝胶的抑菌作用，使各试验菌的加菌回收率均符合《中国药典》要求。结论：本方法用于睾酮凝胶的微生物限度检查，方法可行，准确可靠。

睾酮凝胶，微生物限度检查，方法适用性试验

睾酮凝胶为睾酮缺乏症的替代治疗药，用于因睾酮缺乏而引起的男性性腺功能不足症的替代治疗。根据《中国药典》2015年版通则(草案)“1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”和“1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”的有关规定，在建立睾酮凝胶微生物限度检查方法时，发现该品种有较强的抑菌作用，采用培养基稀释法不能消除其抑菌作用。由于本品为凝胶剂，取常规法制成的1∶10供试液无法通过薄膜过滤法消除其抑菌作用。本方法利用氯化钙与卡波姆中的丙烯酸交联聚合物结合形成钙盐沉淀的原理，从而达到破胶的目的，自然沉降去除沉淀物后，上部溶液可以顺利通过微孔滤膜，经冲洗后，可有效去除睾酮凝胶的抑菌作用，使各试验菌的加菌回收率均达到满意的效果[1]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 MLS-378IL压力蒸汽灭菌器(松下健康医疗器械株式会社)，SG-403生物安全柜(美国baker公司)，ADS161SMU 超净工作台(日本Yamato株式会社)，SANYO MIR-254恒温培养箱(日本三洋株式会社)，SANYO MIR-554恒温培养箱(日本三洋株式会社)，Whatman 薄膜过滤器(英国沃特曼公司)。

1.2 培养基及稀释剂 胰酪大豆胨琼脂培养基(批号20140106)，沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号20140901)，胰酪大豆胨肉汤培养基(批号20140409)，以上培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号140401)，甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号140124)，pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液(批号1404112)，上述培养基及稀释剂均购自中国食品药品检定研究院。以上市售脱水培养基为本试验按标签说明配制并高压灭菌后备用。

1.3 试剂 无水氯化钙(批号20140112)、氯化钠(批号20140228)，以上试剂均为分析纯，均购自天津市赢达稀贵化学试剂厂。

1.4 菌种 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus,CMCC (B)26003]，枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis,CMCC(B)63501]，铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa,CMCC(B)10104]，白色念珠菌[Candida albicans,CMCC (F) 98001]，黑曲霉[Aspergillus niger,CMCC (F)98003]，均购自中国食品药品检定研究院。

1.5 样品 睾酮凝胶(台湾友华生技医药股份有限公司提供，规格50 mg：1%，批号80181A、80188E、80182A)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 阳性对照菌液的制备

2.1.1.1 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌菌液的制备 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨肉汤培养基中，35 ℃培养18 h；取上述培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液以10倍递增法稀释制成每1 ml含菌数约为50～100 cfu的菌悬液。

2.1.1.2 白色念珠菌菌液的制备 取白色念珠菌的新鲜培养物，接种至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，25 ℃培养48 h；取上述培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液以10倍递增法稀释制成每1 ml含菌数约为50～100 cfu的菌悬液。

2.1.1.3 黑曲霉菌液的制备 取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，25 ℃培养5～7 d后，用0.9%无菌氯化钠溶液5 ml将孢子洗脱，然后用0.9%无菌氯化钠溶液以10倍递增法稀释制成每1 ml含孢子数约为50～100 cfu的孢子悬液。

2.1.2 供试液的制备

2.1.2.1 常规平皿法 取供试品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，混匀，作为1∶10供试液(A供试液)。

2.1.2.2 培养基稀释法 取供试品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至500 ml，混匀，作为1∶50供试液(B供试液)。每1 ml中供试品含量相当于1∶10供试液0.2 ml中的供试品含量。

2.1.2.3 薄膜过滤法 取本品10 g，加5%无菌氯化钙溶液30 ml，振摇，使产生沉淀(破胶)，再加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，混匀，自然沉淀5 min后，取上部溶液作为1∶10破胶供试液(C供试液)。

2.2 菌落计数方法的验证

2.2.1 常规平皿法和培养基稀释法

2.2.1.1 试验组 取A供试液9.9 ml，加入适量浓度的0.1 ml金黄色葡萄球菌菌液，制成菌含量与菌液组(50～100 cfu/ml)浓度一致的供试液，取1 ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。同法制备含枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的供试液，各取1 ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。再分别取白色念珠菌和黑曲霉的供试液1 ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。含每种菌的供试液各平行制备2个平皿，试验重复3次。取B供试液9.9 ml，按A供试液同法操作。

2.2.1.2 菌液组 取适量浓度的0.1 ml金黄色葡萄球菌菌液加pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至10 ml，混匀，制成菌含量50～100 cfu/ml的菌悬液，吸取1 ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。同法制备含枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，各取1 ml至平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基。再分别取白色念珠菌和黑曲霉的菌悬液1 ml至平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。每种菌悬液各平行制备2个平皿。

2.2.2.3 供试品对照组 取A供试液1 ml至平皿中，立即倾注相应培养基，每种培养基平行制备2个平皿。取B供试液1 ml，按A供试液同法操作。

2.2.2.4 结果 常规平皿法3次平行试验，5种菌在两种不同培养基上均受抑制，回收率均为0。而培养基稀释法3次平行试验，5种菌在两种不同培养基上的回收率均小于50%。说明此两种方法无法有效检测睾酮凝胶中的微生物含量，必须重新建立新的菌落计数的验证方法。结果见表1和表2。

2.2.2 薄膜过滤法

2.2.2.1 试验组 取C供试液9.9 ml，加入适量浓度的0.1 ml金黄色葡萄球菌菌液，制成菌含量与菌液组(50～100 cfu/ml)浓度一致的供试液，取1 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液300 ml分次冲洗，取膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上。同法制备含枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的供试液，各取1 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液300 ml分次冲洗，取膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上。再分别取白色念珠菌和黑曲霉的供试液1 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液300 ml分次冲洗，取膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基上。

表1 常规平皿法回收率测定结果(n=3)

表2 培养基稀释法回收率测定结果(n=3)

2.2.2.2 菌液组 依“2.2.1.2”项下方法操作。

2.2.2.3 供试品对照组 按试验组的方法和条件测定供试品本底菌落数。

2.2.2.4 结果 通过3次平行试验，5种菌在两种不同培养基上的回收率均大于50%。说明本方法先用氯化钙溶液与凝胶基质中的卡波姆结合形成沉淀达到破胶的目的，取上部溶液薄膜过滤，经冲洗液冲洗，能充分去除本品中的抗(抑)菌成分，可以用于睾酮凝胶中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查。结果见表3。

表3 薄膜过滤法回收率测定结果(n=3)

2.3 控制菌检查方法的验证

2.3.1 金黄色葡萄球菌检查方法的验证

2.3.1.1 试验组 取C供试液10 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液300 ml分次冲洗，在最后一次冲洗液中加入规定量金黄色葡萄球菌(约50～100 cfu)，取滤膜加入100 ml胰酪大豆胨肉汤培养基中，35 ℃培养24 h。

2.3.1.2 阳性对照组 取规定量的金黄色葡萄球菌(约50～100 cfu)加入100 ml胰酪大豆胨肉汤培养基中，35 ℃培养24 h。

试验组和阳性对照组的培养基均浑浊，取上述培养物划线接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，35 ℃培养24 h，均可见金黄色菌落，外周有黄色环，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润。取平板上典型菌落，经分离、纯化后进行血浆凝固酶鉴定实验，确证为金黄色葡萄球菌。

2.3.1.3 验证结果 阳性对照组检出金黄色葡萄球菌；试验组检出金黄色葡萄球菌；适用性试验结果符合要求。

2.3.2 铜绿假单胞菌检查方法的验证

2.3.2.1 试验组 取C供试液10 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液300 ml分次冲洗，在最后一次冲洗液中加入规定量铜绿假单胞菌(约50～100 cfu)，取滤膜加入100 ml胰酪大豆胨肉汤培养基中，35 ℃培养24 h。

2.3.2.2 阳性对照组 取规定量的铜绿假单胞菌(约50～100 cfu)加入100 ml胰酪大豆胨肉汤培养基中， 35 ℃培养24 h。

试验组和阳性对照组的培养基均浑浊，取上述培养物划线接种至溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，35 ℃培养24 h，均可见灰白色菌落，扁平、无定型、表面湿润，菌落周围有蓝绿色素扩散，经分离、纯化后进行氧化酶试验和绿脓菌素的鉴定试验，确证为铜绿假单胞菌。

2.3.2.3 验证结果 阳性对照组检出铜绿假单胞菌；试验组检出铜绿假单胞菌；适用性试验结果符合要求。证明睾酮凝胶的控制菌检查可以采用上述方法进行。

3 讨论

3.1 由于睾酮凝胶的主要基质是卡波姆，在制备过程中使用乙醇为溶剂，使卡波姆溶胀交联而形成凝胶，造成本品比较黏稠，常规法制备的供试液无法顺利通过微孔滤膜，因此利用氯化钙与卡波姆中的丙烯酸交联聚合物结合形成钙盐沉淀的原理，从而达到使凝胶基质破胶的目的。

3.2 与《中国药典》2010年版相比，《中国药典》2015年版通则(草案)在微生物限度检查项下有较大的变动。培养基体系参照欧洲药典，检验项目由检查细菌数改为检查需氧菌总数。计数方法验证中取消了稀释剂对照组，试验组加阳性菌的顺序由在最后加入平皿中改为从称取样品时就加入，充分模拟样品染菌的状态，从而使验证方法更加客观真实。

3.3 验证试验表明，睾酮凝胶的微生物限度检查方法为：取本品10 g，加5%无菌氯化钙溶液30 ml，振摇，使产生沉淀，再加pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，混匀，自然沉降5 min，作为1∶10供试液。分别取1∶10供试液1 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液300 ml分次冲洗，取滤膜分别依法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检查；取1∶10供试液10 ml薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液300 ml分次冲洗，取滤膜分别依法进行铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌检查。

1 中国药典[S].二部.2010:附录107-116

2015-05-02

R927.1

A

1006-5687(2015)04-0024-03