贺小贤， 宇文亚焕， 尹　宁， 魏洁茹， 胡　瑾

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安　710021)



影响乳酸菌液芯微囊发酵性能的制备工艺条件研究

贺小贤， 宇文亚焕， 尹宁， 魏洁茹， 胡瑾

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安710021)

摘要：为了获得适用于发酵生产Nisin的海藻酸钠(A)-壳聚糖(C)-海藻酸钠(A)乳链球菌6032的液芯微囊，以其发酵液吸光度值OD600、Nisin的效价为综合指标，探讨了影响ACA乳链球菌6032液芯微囊发酵性能的制备工艺条件.在单因素实验的基础上采用Box-Behnken模型响应面设计，建立了乳酸菌ACA液芯微囊制备的三元二次回归模型，并确定了其制备因素的最佳水平值为壳聚糖溶解时间2 h、搅拌速度236 r/min、制备温度33.7 ℃、滴加速度4.9 mL/min.将此条件下制得的乳酸菌ACA液芯微囊发酵生产Nisin，吸光度值OD600为0.181,Nisin效价为5 242 IU/mL，该结果与模型预测值拟合良好，说明响应面分析法优化该实验是有效的.

关键词：制备工艺条件； 发酵性能； ACA乳酸菌液芯微囊

0引言

乳链菌肽(Nisin)亦称乳链球菌素或尼生素，是乳酸链球菌产生的一类初级代谢产物，由34个氨基酸组成的疏水性、小分子多肽化合物[1]，对革兰氏阳性菌和芽孢杆菌具有很强的抑菌作用，是食品、药物管理局和世界卫生组织允许商业化生产的食品添加剂[2]，且已被用于医药卫生行业.

近年来，为解决乳酸菌游离发酵过程中存在的菌体细胞无法重复利用和Nisin产率低下等问题，许多学者对利用细胞微胶囊技术[3,4]发酵生产Nisin进行了研究.

Kordikanlioglu B等[5]和Simsek O等[6]通过构建新的乳酸菌菌株(PLAC7)，增强了其与几丁质的结合力，提高了几丁质乳酸菌微囊的稳定性，实现了连续发酵生产Nisin.王永华等[7]用卡拉胶包埋乳酸菌发酵生产Nisin，得出微囊破损率较高，Nisin效价低于游离水平，但持续稳定发酵的时间较长；焦中高等[8]采用柱式填充床反应器发酵虽可减少微囊破损，但Nisin效价低于摇床发酵；郭凯敏[9]研究表明菌体生长及发酵液Nisin效价最大的时间比游离细胞大约延迟2 h.

付颖丽等[10]得出制备的海藻酸钠(A)-壳聚糖(C)-海藻酸钠(A)E.Coli微囊，在培养时利于菌体细胞的生长和代谢；朱敏莉等[11]不仅确定了ACA液芯微囊的最佳制备工艺条件即各种材料的浓度、pH、各步反应时间，而且也确定了膜强度的显著影响因子是壳聚糖，并证实了其能更好的培养酿酒酵母和大肠杆菌.

相对于酿酒酵母产生的乙醇，乳酸菌代谢产物Nisin的分子量更大，ACA乳酸菌液芯微囊生产Nisin需要进一步研究.但从制备工艺条件中壳聚糖溶解时间、制备温度、滴加速度、搅拌速度四个因素对ACA乳酸菌液芯微囊发酵生产Nisin性能的研究鲜有报道，为了获得适于持续发酵生产Nisin的ACA乳链球菌6032液芯微囊，本文采用响应面法对其制备条件进行了优化研究.

1材料与方法

1.1　材料和仪器

乳链球菌(lactococcuslactis)6032，陕西科技大学食品与生物工程学院416实验室保藏.

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，陕西科技大学食品与生物工程学院416实验室保藏.壳聚糖(DD≧80%~95% 80目AR Japan)；海藻酸钠(AR 国药集团)；无水氯化钙(粒)(AR 天津市天力)；柠檬酸钠(AR 天津市天大)；冰乙酸(AR 天津市耀华)；紫外可见分光光度计(UV-1800，MAPADA)；电动搅拌器(D-2000Y，天津市华兴科技).

1.2　实验方法

1.2.1挤压法制备乳酸菌ACA液芯微囊

将已活化的嗜热乳酸链球菌(6032)按 5%的接种量接于CM种子培养基中，在37 ℃培养18 h，离心(4 500 r，10 min)收集菌泥[12]，用生理盐水调整浓度至3.0~6.0×109cfu/mL.将一定温度的海藻酸钠溶液(10 g/L)与乳酸菌10∶1均匀混合，用一次性5 mL注射器以一定速度滴加到2% CaCl2搅拌溶液中，固化2 h形成海藻酸钙凝胶珠.用生理盐水冲洗后，将其置于壳聚糖搅拌溶液(5.5 g/L，pH5.5)中，30 min缓慢成膜，制成海藻酸钙-壳聚糖胶囊，再用0.05%海藻酸钠溶液覆膜30 min制得海藻酸钠(A)-壳聚糖(C)-海藻酸钙固芯微胶囊，最后用柠檬酸钠溶液(pH5.5，5%)液化15 min，最终制成乳酸菌ACA液芯微囊.

1.2.2乳酸菌ACA液芯微囊发酵及评价

利用上述制备的乳酸菌ACA液芯微囊，在蔗糖替代葡萄糖的MRS培养基[13]中发酵生产Nisin[14].将发酵结束后的发酵液稀释2倍，与同一发酵条件下的空白培养基对照，在600 nm处测量吸光度值.将发酵液调pH至2.5，采用琼脂扩散法[15]对Nisin的抑菌效价进行测定.

1.2.3单因素实验设计

以壳聚糖溶解时间、制备温度、滴加速度、搅拌速度，进行单次单因素实验，每个水平重复3次取其平均值，分析各因素对乳酸菌ACA液芯微囊制备及发酵生产Nisin的影响.

1.2.4响应面法实验设计

根据单因素实验的结果，在壳聚糖溶解2 h时，通过Design-Expert软件采用3因素3水平的Box-Behnken模型响应面设计，考察了搅拌速度、制备温度、滴加速度3个单因素及其交互作用对实验结果的影响.

2结果与讨论

2.1　不同单因素对微囊发酵性能的影响

2.1.1壳聚糖溶解时间对微胶囊发酵性能的影响

壳聚糖溶液中的NH3+与海藻酸钠中的COO-通过正、负电荷作用形成ACA液芯微囊膜.壳聚糖溶解时间对其溶解和降解都有一定的影响.溶解时间短，无法提供大量的NH3+，成膜较差；溶解时间长，壳聚糖降解大，分子量减小，虽易成膜，但其热稳定性减弱，破坏程度更大，微囊稳定性差.为了确定最适溶解时间，设计了不同溶解时间进行实验，实验结果如图1所示.

图1　壳聚糖溶解时间对微胶囊发酵性能的影响

由图1得出，在壳聚糖溶解时间2 h时，吸光度值OD600最小值为0.301，Nisin效价最大值为4 980 IU/mL；在溶解时间5 h时，吸光度值OD600最大值为0.351，Nisin效价最小值为4 600 IU/mL，其数值相差不大.可能是随壳聚糖溶解时间延长，提供了大量NH3+和分子量较小的壳聚糖，增加了膜厚度；但其热稳定性减弱，更易被破坏，微囊膜的稳定性变差.两者作用相互抵消，对微囊发酵性能有影响.响应面设计不考虑溶解时间的影响，故选择2 h为最佳溶解时间.

2.1.2制备温度对微胶囊发酵性能的影响

制备温度不但通过改变壳聚糖和海藻酸钠分子的结构、粘度与运动性能等来影响着微囊的性能，也影响着乳酸菌的存活率，所以制备温度对微囊发酵性能有一定的影响.考察了不同制备温度对微囊发酵性能的影响，实验结果如图2所示.

图2　制备温度对微胶囊发酵性能的影响

图2显示，在34 ℃之前，随着制备温度的增大，吸光度值OD600持续降低，Nisin效价不断增大，在34 ℃时，吸光度值OD600降到最小，Nisin效价达到最大.可能是随着温度升高，海藻酸钠和壳聚糖分子粘度降低，分子运动加快，促进其溶解和降解为小分子，利于成膜，增加了膜的厚度；热稳定性减弱使其结构破坏，但微囊稳定性整体提高，破损率降低.在34 ℃时细胞游离数目最少，且菌体细胞存活率最高，利于囊内细胞持续发酵生产Nisin.

2.1.3滴加速度对微胶囊发酵性能的影响

在往CaCl2溶液中滴加海藻酸钠时，滴加速度对微囊大小影响显著.滴加速度慢微囊大，内扩散阻力大，不利于传质；滴加速度快微囊小，其比表面积大，传质速度快，频次高，微囊易受损.设计不同滴加速度实验，结果如图3所示.

由图3可知，在滴加速度为5 mL/min时，Nisin效价达到最高，而吸光度值OD600并不是最低，可能是此条件下制得的微囊大小、比表面积适宜，益于营养物和产物Nisin传质扩散，能够为囊内细胞及时供给营养和解除产物抑制，利于Nisin生成，但同时传质频率、次数的加快也造成微囊破损较大，细胞游离数较多.

图3　滴加速度对微胶囊发酵性能的影响

2.1.4机械搅拌速度对微胶囊发酵性能的影响

在乳酸菌ACA液芯微囊的制备过程中，搅拌速度主要是通过改变流体的雷诺数，影响微囊所受的切变力.搅拌速度不同时，微囊所受的主要作用力不同.搅拌速度慢，微囊在流体中主要受粘性力作用，成形不规则，膜厚度及均匀性较差；搅拌速度快，流体惯性力对其影响显著，会直接使微囊破损.为此设计如下实验，结果如图4所示.

图4　搅拌速度对微胶囊发酵性能的影响

由图4可以看出，在搅拌速度为250 r/min时，吸光度值OD600最小，Nisin效价最大.此后，随着机械搅拌速度不断增大，吸光度值OD600一直增大，而Nisin效价持续降低，可能是流体的惯性力太大使微囊破损严重，细胞游离数目增多，受环境干扰，细胞活性减少，不利于发酵生产.

2.2　响应面模型的建立以及验证实验

2.2.1三元二次回归模型的建立

响应值R1(OD600)分析方案及实验结果如表1所示，方差分析如表2所示.对表1中R1的数据进行方差分析后得到模型的二次回归方程为R1=7.32-3.15E-003*A-0.26*B-0.94*C+3.00000E-005*A*B+1.88E-004*A*C-1.25E-003*B*C+2.78E-006*A＾2+3.73E-003*B＾2+0.097*C＾2.由表2可知，该回归模型极显著(p<0.000 1)，失拟项(p=0.105 1>0.05)不显著，同时该模型的回归系数(R2)为0.998 5，说明拟合程度很高，能很好反应响应值R1(OD600)的变化.此外，除交互项BC不显著外，一次项A、B、C，交互项AB、AC，二次项A2、B2和C2都极显著.

表1　响应面实验设计及结果

表2　响应值1回归分析结果统计

表3　响应值2回归分析结果统计

续表3

2.2.2因素间的交互作用

图5~7直观地给出了各个因子交互作用对R1值的响应面3D和等值线分析图.从响应面的最低点和等值线可以看出, 在所选的范围内存在极值, 既是响应面的最低点, 同时也是等值线最小椭圆的中心点.由响应面的倾斜度可以看出各因素间交互影响大小依次为：AC>AB>BC.

图5　A和B交互效应对细胞游离数OD600的影响

图6　A和C交互效应对细胞游离数OD600的影响

图7　B和C交互效应对细胞游离数OD600的影响

响应值R2(Nisin效价)的响应面和等高线如图8~10所示，经比较可以看出，图8中响应面图坡度倾斜度较大，表明A与B交互作用较大.

图8　A和B交互效应对微囊发酵液Nisin效价的影响

图9　A和C交互效应对微囊发酵Nisin效价的影响

图10　B和C交互效应对微囊发酵Nisin效价的影响

对响应面结果利用软件进行最优化分析，得出回归模型的Nisin效价的最大估计值为5 252.4 IU/mL，吸光度值OD600为0.179，相应的制备条件为搅拌速度235.63 r/min、制备温度33.67 ℃、滴加速度4.9 mL/min.考虑实际操作将上述条件修正为搅拌速度236 r/min、制备温度33.7 ℃、滴加速度4.9 mL/min.在修正后条件下，壳聚糖溶解2 h所制得的乳酸菌ACA液芯微囊发酵生产Nisin，进行3次平行验证试验，Nisin效价为5 242 IU/mL，吸光度值OD600为0.182，与理论预测值相比，其相对偏差为分别0.20%和2.2%，说明响应面拟合所估计的实验结果可靠.

3结论

(1)影响ACA乳酸菌液芯微囊发酵性能的制备条件，单因素实验结果为壳聚糖溶解时间2 h、搅拌速度250 r/min、制备温度34 ℃、滴加速度5.0 mL/min；

(2)响应面优化结果分析表明，搅拌速度、制备温度、滴加速度对吸光度值OD600影响均显著；各因素对Nisin效价影响的大小依次为：制备温度>滴加速度>搅拌速度.

(3)响应面法优化的最优制备条件为搅拌速度236 r/min、制备温度33.7 ℃、滴加速度4.9 mL/min.在此条件下制得的ACA乳酸菌液芯微囊进行发酵生产时，Nisin效价为5 242 IU/mL，吸光度值OD600为0.182.

参考文献

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The liquid core microcapsules preparation conditions

affect onLactobacillusfermentation

HE Xiao-xian, YUWEN Ya-huan, YIN Ning, WEI Jie-ru， HU Jin

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:In order to obtain the ACA liquid core microcapsules oflactococcuslactis6032 for Nisin fermentation,absorbance value of OD600and titer unit of Nisin in the broth as comprehensive indicators,the liquid core microcapsules preparation conditions affect on fermentation ofLactobacilluswas discussed.Based on one-factor experimental design,the quadratic model was founded by the Box-Behnken response surface model.The optimal value of each preparation condition were chitosan dissolution time 2 h,stirring speed 236 r/min,temperature 33.7 ℃,dropping rate 4.9 mL/min.Under these conditions,the absorbance value of OD600was 0.181 and the titer unit of Nisin was 5 242 IU/mL,which is consistent with the predicted value.These showed that it is effective for optimizing preparation conditions by response surface methodology.

Key words:preparation conditions; fermentation; ACA liquid core microcapsules ofLactobacillus

作者简介:贺小贤(1962-)，女，陕西西安人，教授，研究方向：发酵工程、生物化工

基金项目：国家自然科学基金青年项目(31301059)； 陕西省教育厅自然科学专项科研计划项目(14JK1089)

*收稿日期:2015-10-20

中图分类号：TQ920.1

文献标志码：A

*文章编号：1000-5811(2015)06-0132-06