吕嘉枥， 李文娟

(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安　710021)



微波辅助提取冠突散囊菌黄色素工艺研究

吕嘉枥， 李文娟

(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安710021)

摘要：基于Box-Behnken响应面试验设计确定了冠突散囊菌液体发酵菌丝体黄色素的最佳提取条件.采用单因素法确定影响冠突散囊菌黄色素得率的主要因素，即料液比、提取温度和微波功率，进一步利用Box-Behnken模型对其进行响应面优化.结果表明：影响黄色素提取效果的最主要因素是料液比和提取温度，其次是微波功率.确定最佳提取工艺为料液比1∶38(w/v)，提取温度56 ℃，微波功率457 W.该条件下黄色素得率10.08%.实测结果与响应面拟合所得方程的预测值符合良好，采用响应面法对微波辅助提取冠突散囊菌黄色素的提取条件优化合理.

关键词：冠突散囊菌； 液体发酵； 黄色素； 微波辅助提取

0引言

天然色素对人体无毒无害、安全性高，同时兼具一定的营养价值或药理作用，食品、化妆品和医药行业对天然色素的需求量在逐年增加，因此研究和开发无毒无害的天然色素是现在和未来食品色素发展的主要方向[1].

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)[2-6]是茯砖茶经“发花”工序自然形成的一种益生菌，也是“发花”过程中的优势菌群.在特定的条件下，冠突散囊菌可以在茯砖茶中形成黄色闭囊壳并均匀的附着在茯砖茶中，俗称“金花”，因此又被称为“金花菌”.边疆少数民族一般以冠突散囊菌的数量来评价茯砖茶品质的优劣.冠突散囊菌赋予了茯砖茶特有的色、香、味，并且具有促消化、降脂减肥、调节糖代谢和抑制肿瘤细胞、治疗心血管疾病[7-9]等保健功效，其作用机理还没有被深入的研究.

金黄色的闭囊壳中含有大量黄色物质，宋鲁彬[9]发现茯砖茶石油醚洗脱组分中含有大量的色素物质；李玉婷[10]对金花菌黄色素的理化性质进行了研究；韩蓉、吕嘉枥等[11]利用超声波对茯砖茶冠突散囊菌色素进行了提取，得到了色素精制品,并对其结构进行了初步分析.

冠突散囊菌黄色素作为一种微生物天然色素，不仅是单纯的着色剂，而且可能还是食品的营养强化剂，是提高食品营养与保健作用的理想添加剂，如果能够大量生产和开发，将会产生巨大的社会效益和经济效益.

微波辅助提取法是利用微波能提高得率的一种新技术，具有微波功率小、辐射时间短，萃取效率高、能耗低、节省试剂等特点[12]，已应用于多种色素的提取[13-16].目前冠突散囊菌黄色素多采用超声波辅助提取法，本试验借助微波辅助对冠突散囊菌黄色素进行提取，并利用响应面法对提取工艺进行优化，这为冠突散囊菌黄色素的进一步开发利用提供技术支持，具有广阔的市场前景.

1材料与方法

1.1　菌种

冠突散囊菌由陕西科技大学微生物研究室从苍山茶叶有限责任公司所产茯砖茶中分离纯化得到.

1.2　培养基

液体PDA(20%土豆浸汁、2%蔗糖、0.3% NH4NO3、KH2PO40.1%),121 ℃灭菌20 min.

1.3　主要仪器设备

HZQ-F160振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，HC-3018R高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)，UV2600紫外-可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司),101-1型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)，WD900(MG-5562S)型LG微波炉(北京科伟永兴仪器有限公司).

1.4　实验方法

1.4.1冠突散囊菌菌丝体的制备

将斜面保存的菌种进行活化，接入500 mL的三角锥形瓶中(25%装液量)，放置于28 ℃、120 r/min的恒温摇床上培养至发酵液颜色从澄清透明变为亮黄色为止，用定量滤纸过滤得到菌丝体，用蒸馏水洗涤3次，吸干其表面的水分.置于30 ℃干燥箱中烘干，研钵研磨后得到菌丝体粉末备用.

1.4.2工艺流程

菌丝体→ 粉粹→ 过筛→ 菌丝体粉末→ 水浴浸提→ 微波辐射→ 过滤分离浓缩→ 自然挥发干燥→ 色素产品.

1.5　黄色素得率的测定

以黄色素得率为试验指标，计算公式如下：

式中，m1表示菌丝体粉末干重，m2表示提取黄色素的重量.

1.6　试验设计

选择不同种类的有机溶剂、料液比、提取时间、提取温度、提取次数、微波功率、微波作用时间进行单因素试验，并分析各个因素对冠突散囊菌黄色素得率的影响.在此基础上，选择其中对黄色素得率影响显著的因素，进行响应曲面优化，确定最佳的提取工艺条件.

1.6.1提取溶剂对黄色素得率的影响

准确称取适量冠突散囊菌菌丝体粉末，控制体系料液比1∶20(g/mL)、提取时间30 min、微波功率360 W、微波作用时间2 min，利用石油醚、甲醇、乙醇、环己烷、乙酸乙酯、丙酮对黄色素进行提取.观察不同色素提取液颜色并计算色素得率，分析不同有机溶剂对色素得率的影响.

1.6.2提取温度对黄色素得率的影响

准确称取适量冠突散囊菌菌丝体粉末，以石油醚为提取剂，控制体系料液比1∶20(g/mL)、提取时间30 min、微波功率360 W、微波作用时间2 min，设置不同提取温度30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃.计算黄色素得率，分析不同提取温度对黄色素得率的影响.

1.6.3料液比对黄色素得率的影响

准确称取适量冠突散囊菌菌丝体粉末，以石油醚为提取剂，控制体系提取温度50 ℃、提取时间30 min、微波功率360 W、微波作用时间2 min，设置不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL).计算黄色素得率，分析不同料液比对黄色素得率的影响.

1.6.4提取时间对黄色素得率的影响

准确称取适量冠突散囊菌菌丝体粉末，以石油醚为提取剂，控制体系提取温度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、微波功率360 W、微波作用时间2 min，设置不同提取时间20 min、30 min、40 min、50 min、60 min.计算黄色素得率，分析不同提取时间对黄色素得率的影响.

准确称取适量冠突散囊菌菌丝体粉末，以石油醚为提取剂，控制体系提取温度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、提取时间40 min、微波作用时间2 min，设置不同微波功率180 W、360 W、540 W、720 W、900 W.计算黄色素得率，分析不同微波功率对黄色素得率的影响.

1.6.6微波作用时间对黄色素得率的影响

准确称取适量冠突散囊菌菌丝体粉末，以石油醚为提取剂，控制体系提取温度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、提取时间40 min、微波功率360 W，设置不同微波作用时间1 min、2 min、3 min、4 min、5 min.计算黄色素得率，分析不同微波作用时间对黄色素得率的影响.

1.6.7提取次数对黄色素得率的影响

准确称取适量冠突散囊菌菌丝体粉末，以石油醚为提取剂，控制体系提取温度50 ℃、料液比1∶30(g/mL)、提取时间40 min、微波功率360 W、微波作用时间2 min，设置不同提取次数1次、2次、3次、4次、5次.计算黄色素得率，分析不同提取次数对黄色素得率的影响.

1.6.8响应面法对黄色素提取试验设计

根据单因素试验，选择对黄色素得率影响最为显著的3个因素，进行响应曲面优化，以确定最佳的黄色素提取工艺条件.

表1　Box-benhnken试验设计因素与水平

2结果与讨论

2.1　微波辅助提取单因素试验结果与分析

2.1.1提取溶剂对黄色素得率的影响

本研究主要采用随机抽样的方法，选取宁夏回族自治区N县乡村初中作为研究场域，共抽取210位教师作为研究对象。调查共发放210份问卷，最后统计回收问卷180份，回收率为85.7%，其中有效问卷155份，有效率为86.1%，符合统计处理的有效性原则。

由图1可知,采用6种不同有机溶剂对等量冠突散囊菌菌丝体粉末中黄色素进行提取，甲醇得率最高，达到26.02%，乙醇14.24%，乙酸乙酯10.56%，石油醚、环己烷和丙酮得率相差不大，分别为7.06%、7.20%和8.35%.通过观察各种有机溶剂黄色素提取液的颜色可以看出，甲醇和乙醇提取液为深红色，丙酮和乙酸乙酯提取液为浅红色，石油醚和环己烷提取液为亮黄色.根据冠突散囊菌特性，甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯不适宜作为黄色素的提取溶剂；石油醚和环己烷提取液虽均为黄色，但是环己烷提取液偏红，黄色素得率也差别不明显，故石油醚为冠突散囊菌黄色素较佳提取溶剂.

图1　不同有机溶剂对黄色素得率的影响

2.1.2提取温度对黄色素得率的影响

由图2可知,不同的提取温度对冠突散囊菌黄色素得率有不同的影响.随着温度的增加.黄色素得率也在依次增加.提取温度为30 ℃时，黄色素得率为6.97%；提取温度为40 ℃时，黄色素得率为7.34%；提取温度为50 ℃时，黄色素得率为7.98%；超过50 ℃后，黄色素得率增长幅度不大，而且提取温度过高，不仅会增加能量消耗并造成部分溶剂蒸发损失，同时黄色素的稳定性会下降，甚至引起色素的降解.故50℃为较佳提取温度.

图2　提取温度对黄色素得率的影响

2.1.3料液比对黄色素得率的影响

由图3可知,随着料液比的增加，得率逐渐增大，料液比为1∶10时，黄色素得率为7.03%；料液比为1∶20时，黄色素得率为7.53%；料液比为1∶30时，黄色素得率为8.12%；当料液比继续增加直至1∶50时，黄色素得率为8.5%，增加不显著.而高料液比会造成溶剂和能量的浪费，故1∶30为较佳料液比.

图3　料液比对黄色素得率的影响

2.1.4提取时间对黄色素得率的影响

由图4可知，随着提取时间的增加，黄色素得率先增大后保持恒定，提取时间为20 min时，黄色素得率为7.69%；提取时间为40 min时，黄色素得率达到8.30%.延长提取时间，冠突散囊菌可以与溶剂充分作用，故黄色素的提取量增加，继续延长时间，黄色素得率增加不显著.而过长的提取时间不仅会导致黄色素分解，同时考虑到经济因素和不影响整个工艺流程的效率，提取时间为40 min.

2.1.5微波功率对黄色素得率的影响

由图5可知，采用微波辅助提取的效果明显比对照组(功率为0 W)好，0 W时黄色素得率为7.78%，180 W时黄色素得率为7.78%，360 W时黄色素得率为7.94%，540 W时黄色素得率为8.56%.微波辐射功率对提取黄色素效果显著：在0～540 W之间增加微波功率，黄色素得率也随之增大；超过540 W后，增加功率，黄色素得率变化不显著；当功率为900 W时黄色素得率增加，分析可能是因辐射功率越高，物系吸收微波能越多，有利于有效成分溶出，但是火力过大，其强热效应可能对有效成分产生破坏作用，故选择360 W为较佳提取功率.

2.1.6微波作用时间对黄色素得率的影响

由图6可知，随着微波时间的延长，黄色素的得率先增大后减小，最后趋于平缓.微波作用1 min时，黄色素得率为8.12%；微波作用时间为3 min时，黄色素得率为8.40%；超过3 min后得率不再增长.延长微波时间有利于冠突散囊菌黄色素的浸出，黄色素基本溶解完全，继续延长微波时间提取液颜色会出现浅红色，说明微波作用时间过长，会对黄色素的结构产生不良的影响，故选择微波作用时间为2 min.

图4　提取时间对黄色素得率的影响

图5　微波功率对黄色素得率的影响

图6　微波作用时间对黄色素得率的影响

2.1.7提取次数对黄色素得率的影响

由图7可知，提取次数对黄色素的得率有一定的影响.提取1次，黄色素得率为7.86%；提取第2次，黄色素得率达到8.43%；提取次数超过2次后，黄色素提取液颜色变浅，黄色素得率变化幅度减小.故提取2次后，黄色素基本上提取完全，继续提取，会造成溶剂的大量浪费，而且对黄色素得率贡献不大，选择提取2次比较经济环保，同时也最大化的利用了冠突散囊菌菌丝体.

图7　提取次数对黄色素得率的影响

2.2　响应面法优化冠突散囊菌黄色素提取工艺

2.2.1响应面优化

采用Design-Expert 8.05中的Box-Benhnken试验设计原理，以黄色素得率为响应值.响应面分析方案与结果如表2所示.

表2　微波辅助提取黄色素实验方案与结果

2.2.2模型的建立及显著性检验

响应面二次回归方程方差分析见表3.由表3可以看出在所选的各因素水平范围内，对黄色素得率影响较大的为料液比、提取温度，其次为微波功率.其中，料液比、提取温度的一次项，料液比、提取温度、微波功率的二次项对响应值的影响极显著；微波功率的一次项对响应值的影响显著；料液比和提取温度的交互项，提取温度和微波功率的交互项对响应值的影响极显著；料液比和微波功率的交互项对响应值的影响显著.利用Design-Expert 8.05软件对表中的数据进行多元回归拟合，得到黄色素的得率(Y)对料液比(A)、提取温度(B)、微波功率(C)的二次多项回归模型：Y=9.79+0.47A+0.30B+0.12C+0.39AB+0.16AC+0.33BC―0.33A2―0.55B2―0.74C2，该方程的相关系数R2=0.992 5.由表3可知，整体模型达极显著水平(P<0.01)表明该二次方程模型比较显著，失拟项不显著(P=0.965 4).该方程对试验拟合较好，可以对试验范围内不同条件下的得率进行预测.另外，该模型的变异系数(c.v.)为1.05%.变异系数是衡量每个平均值偏离情况的参数，其值越小，重复性越好.分析得到的微波辅助提取冠突散囊菌黄色素工艺条件的最佳值为：料液比(g/mL)为1∶38，提取温度为56 ℃,微波功率为457 W，模型预测结果为10.12%.

表3　响应面二次回归方程方差分析

注：P值在5%水平以下表示显著，1%水平以下表示极显著.

2.2.3提取工艺的响应面分析与优化

用Design-Expert 8.05软件，根据回归方程分析作响应面图，如图8~图10所示.

依据各因素A、B和C对响应值Y所构成的三维空间的曲面图，可反映各因素对其响应值的影响.响应面可较为直观的看出各因素对黄色素得率的影响，曲面越陡峭，表明该因素对黄色素得率的影响越大，响应值的变化越大.

由图8、9和图10可知，料液比和提取温度的曲面陡峭，对响应值(黄色素得率)的交互作用明显；料液比和微波功率的响应曲面的坡度较陡峭，表明响应值(黄色素得率)对料液比和微波功率的交互作用也明显；提取温度和微波功率的响应面的坡度同样陡峭，说明响应值(黄色素得率)对提取温度和微波功率的变化敏感.这些结果都与回归方程的方差分析相吻合，表明响应面优化设计能够较好的反映出试验所设定的三个因素对黄色素得率的影响，对各因素的考察较为全面、系统，试验结果具有一定的应用价值.

图8　料液比和提取温度对黄色素得率的影响

图9　料液比和微波功率对黄色素得率的影响

图10　提取温度和微波功率对黄色素得率的影响

2.2.4最佳工艺条件的确定及验证试验

结合二次回归的数学模型分析结果，最优条件为料液比(g/mL)为1∶37.6，提取温度为55.9 ℃，微波功率为457.2 W .将单因素试验所得最佳条件和响应面二次回归所得最佳条件进行试验，每个进行三次平行试验，结果如表4所示.

表4　验证试验结果

根据实验具体情况，结合实际操作的可行性，将最佳工艺确定为料液比(g/mL)1∶38，提取温度56 ℃，微波功率457 W，说明此模型可靠，结果具有一定的应用价值.

3结论

通过单因素实验并结合Box-Behnken设计响应曲面分析研究了冠突散囊菌菌丝体黄色素的工艺条件.利用Design-Expert 8.05软件对实验数据进行分析，得到了得率的回归方程Y=9.79+0.47A+0.30B+0.12C+0.39AB+0.16AC+0.33BC―0.33A2―0.55B2―0.74C2，优化得到的提取方案为：料液比(g/mL)为1∶38，提取温度为56 ℃,微波功率为457 W，模型预测结果为10.12%.在该工艺条件下进行验证试验，得率达到10.08%.

微波辅助提取冠突散囊菌黄色素缩短了提取时间，得率较高，试验结果有应用价值；响应面优化微波辅助提取工艺，对各因素的考察较为全面、系统，试验结果具有一定的应用价值；后期应对冠突散囊菌黄色素的纯化工艺进行深入研究，使试验结果更具有实际应用价值.

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Study on microwave-assisted extraction technology

of pigments fromEurotiumcristatum

LV Jia-li， LI Wen-juan

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:The conditions for the aqueous extraction of pigments fromEurotiumcristatumwere optimized with Box-Behnken design under response surface methodology.The major extraction factors of pigments fromEurotiumcristatumwere obtained by single factor experiments.And they were solvent-solid ratio,extraction temperature,microwave power on yield of extracted for pigments from by Box-Behnken design.The optimal conditions of microwave-assisted extraction for pigments were:solvent-solid ratio 1∶38(w/v),extraction temperature 56 ℃,microwave power 457 W.Under these conditions,average yield of pigments was 10.08%.And the measured value was consistent with the predicated value, which indicated the applicability of RSM to the optimization of extraction of pigments fromEurotiumcristatum.

Key words:Eurotiumcristatum; liquid fermentation; pigments; microwave-assisted extraction

作者简介:吕嘉枥(1964-)，女，陕西三原人，教授，研究方向：应用微生物学

基金项目：陕西省教育厅专项科研计划项目(2010JK446)； 咸阳市科技计划项目 (2013K06-09)

*收稿日期:2015-09-13

中图分类号：TS201.3

文献标志码：A

*文章编号：1000-5811(2015)06-0121-06