赵 亮 徐艳丽 何 孟 李 敏*

1(福建师范大学生命科学学院，福州 350108)2(新乡医学院生命科学技术学院，河南 新乡 453003)



骨髓间充质干细胞复合蛛丝蛋白血管支架构建小直径组织工程血管的研究

赵 亮1,2徐艳丽1何 孟1李 敏1*

1(福建师范大学生命科学学院，福州 350108)2(新乡医学院生命科学技术学院，河南 新乡 453003)

应用动态培养的方式，将骨髓间充质干细胞和蛛丝蛋白血管支架复合培养构建小直径组织工程血管，为心血管疾病修复提供新的血管移植物来源。将间充质干细胞种植到管状的血管支架内腔，应用动态培养的方法构建小直径组织工程血管，并根据扫描电子显微镜观察、HE染色、缝合强度测试、DNA含量检测、羟脯氨酸测定等指标评价组织工程血管的形成程度。复合培养7 d后，细胞在纳米纤维支架表面充分铺展，并且可以迁移到纤维内部生长，细胞与血管支架表现出较好的相容性。组织工程血管的缝合强度经测试为(0.95±0.12) N/针，是天然血管的29.6%。随着时间的持续，组织工程血管中的羟脯氨酸含量和DNA含量不断增加，羟脯氨酸含量在第14和第28 d分别达到0.16和0.2 μg/mg, 且与对照组相比在统计学上有显著性差异。成功构建了一种小直径组织工程血管，各指标较为优良，为其临床应用奠定了基础。

蛛丝蛋白；组织工程血管；骨髓间充质干细胞；缝合强度

引言

血管移植手术是治疗心血管疾病的主要手段。自体血管和人工合成血管是临床上常用的血管移植物，但自体血管来源有限，难以满足临床需求。人工合成血管如涤纶(Dacron)和膨胀聚四氟乙烯(ePTFE)在大直径血管(内径>6 mm)移植中有较佳的效果，但在小直径血管(内径<6 mm)移植中容易出现形成血栓、内膜增生、血管狭窄甚至阻塞等现象。组织工程血管技术为小直径血管移植物提供了新来源。组织工程血管的构建主要有两个方面：种子细胞的选取和组织工程血管支架的制备。支架材料为种子细胞的增殖和迁移提供支撑结构，对组织工程血管的构建起关键作用。本研究室在前期构建了(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)蛛丝蛋白双层小直径血管支架，并探讨了其生物力学性能和体外降解性，发现其生物力学性能优良，体外降解速度适宜，适合用于构建小直径组织工程血管[1-2]。本研究将骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)种植到管状的血管支架内腔，应用动态培养的方法初步构建小直径组织工程血管，并根据扫描电子显微镜观察、HE染色、缝合强度测试、DNA含量检测、羟脯氨酸测定等来评价组织工程血管的形成程度，从而为后续的血管缺损修复奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)蛛丝蛋白双层小直径血管支架(自制[1-2])、MSC(实验室前期分离)、98%甲酸和水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)、动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)、羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程公司)。

内皮细胞化诱导培养基：含有2 mmol谷氨酰胺、10 ng/mL人血管内皮细胞生长因子和10 ng/mL人碱性成纤维生长因子的间充质干细胞培养基。

智能化静电纺丝仪(自主专利，福州凯特电气有限公司)、JSM-7500F型冷场发射扫描电子显微镜(日本电子株式会社)、MDH-616A型抽湿机(广州森井电机株式会社)、ALJ-02B手动螺旋式测试机(福州艾普仪器有限公司)、FDU-1100型冷冻干燥仪(日本EYELA公司)、NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo Scientific 公司)。

1.2 方法

1.2.1 内层和外层纺丝液的配制

以98%甲酸为溶剂，配制pNSR16∶PCL∶CS质量比为5∶85∶10的混合电纺溶液作为内层纺丝液，配制pNSR16∶PCL∶Gt质量比为5∶85∶10的混合电纺溶液作为外层纺丝液，两种纺丝液的总浓度分别为10%和18%，各成分含量见表1。应用恒温振荡器在室温下振荡溶解纺丝液，使其形成均一透明的溶液。

表1 纺丝液中各成分含量(总体积10 mL)

Tab.1 Composition content of blend solution (10mL system)

纺丝液成分含量/g内层pNSR16PCLCS00508501外层pNSR16PCLGt009153018

1.2.2 静电纺丝

将装有纺丝液的注射器放置在推进器上，以旋转轴为接收装置，将高压发生装置与注射器针头相连接，地线与接收棒相连接。电纺参数设置为：电压18 kV、固化距离15 cm、挤出速度1 mL/h、转轴直径1.2 mm、温度为30℃、相对湿度50%。启动高压发生装置和推进器，纺丝液依靠静电场力在飞向接收棒的过程中被拉直形成管型的复合纳米纤维支架。内层制备后，以内层的外表面为接收棒电纺外层纺丝液。

1.2.3 大鼠MSCs种植与动态培养

将双层血管支架置入75%酒精消毒液中浸泡24 h，无菌PBS洗涤2 min×3次，无菌操作台中自然干燥，备用。在种植细胞之前，用5-0缝合线将血管支架一端打结封闭 (见图1)。用移液枪将MSCs悬液按l×106/mL的细胞密度小心注入血管支架内腔，尽量避免气泡，再打结封闭另一端。在血管支架周围滴加数滴培养基，防止干燥；37℃培养4 h后，翻转血管支架，解开打结的一端再次注入干细胞悬液，然后重新打结；4 h后，剪去两端缝合线，加入3 mL内皮细胞化诱导培养基继续培养。在培养过程中，每隔 24 h使细胞-血管支架复合物处于动态培养1 h。具体操作方法是将载有细胞-血管支架复合物的培养皿包于无菌手套中，套口密封，保证无菌，然后将复合物放至振荡器上，振荡培养1 h后再放回细胞培养箱中继续培养。

图1 细胞种植于双层血管支架Fig.1 Cells was implanted in bilayer vascular scaffold

1.2.4 扫描电镜 (SEM) 观察

用2%戊二醛将培养7 d后的组织工程血管固定1 h后，10%、30%、50%、70%、90%乙醇和无水乙醇逐级脱水。放置在载物台上，喷金处理，用扫描电镜观察。

1.2.5 冰冻切片和HE染色

培养7 d后，组织工程血管取样，4℃条件下用4%多聚甲醛固定1 d后，应用30 %蔗糖溶液进行脱水2 d，OCT包埋，应用冰冻切片机冰冻切片，厚度10μm，行组织HE染色分析。苏木素染色30～60 s后用流水冲洗。用1%盐酸乙醇分化1～3 s，再次流水冲洗。伊红染色2～3 min，流水稍冲洗。脱水、透明，应用中性树胶封片，镜检。以未种植细胞的蛛丝蛋白支架材料为对照组。

1.2.6 缝合强度测试

培养14 d后，按照smitten的实验方法测试缝合强度[3]。用10-0的涤纶手术线将组织工程血管与硬质模板缝在一起 (n=10)，针孔间距1～2 mm，针孔距端部1～2 mm，在ALJ-02B手动螺旋式测试机上拉伸直至针孔处断裂，拉伸速率为5 mm/min。取断裂时的拉力值除以针孔数，获得每针能承受的最大拉力，单位取为N/针。

1.2.7 DNA含量检测

分别培养7、14、28 d后，取出组织工程血管，以打孔器轻柔打孔随机取膜片, 应用TE将细胞消化下来，然后用动物组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA, 经NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA的含量(n=3)。

1.2.8 羟脯氨酸测定

精确称量湿重为30～50 mg的组织工程血管放入试管中，然后在试管中添加1 mL水解液，充分混匀。95℃水浴20 min，每10 min时进行一次摇匀。用流水将试管冷却后，在每支试管内加入指示剂1滴，摇匀。然后每管加入1 mL调pH甲液，摇匀。逐滴添加pH乙液，直至溶液的颜色成为黄绿色，在此时这种混合溶液的pH应在6.0～6.8左右。加入蒸馏水至10 mL，使其充分混匀。取60～80 mg活性炭加入到3 mL混匀后的溶液中，再次摇匀，通过3 500 r/min离心10 min，取1 mL上清液做检测。按照试剂盒说明书加样、摇匀，在60℃下水浴15 min以后，室温冷却，3 500 r/min离心10 min，测量在550 nm处上清液的吸光度(n=3)。按照以下公式计算羟脯氨酸含量：

(1)

式中，C1为羟脯氨酸含量(μg/mg湿重)；A1为测定管吸光度；A2为空白管吸光度；A3为标准管吸光度；C2为标准管含量(5 μg/mL)；V为水解液总体积(10 mL)；W为组织湿重(mg)。

1.2.9 统计方法

数据以均数±标准差表示，采用方差分析比较，两两比较采用t检验，P<0.05 表示在统计学上有显著性差异。

2 结果

2.1 双层蛛丝蛋白血管支架的形态结构

如图2所示，双层蛛丝蛋白血管支架的双层纤维形貌有较大的不同。内层纤维直径分布较为均匀，孔隙相对也较小，相互连接成网状分布，可为内皮细胞提供更多的黏附位点，加快内皮层的形成；而外层纤维直径分布较为分散，孔隙较大，有利于平滑肌细胞的黏附和迁入，双层蛛丝蛋白血管支架的微观结构差异是由外层有明胶，而内层含有壳聚糖所导致。调节纺丝时的电压、纺速、温度、湿度可调控纤维形貌变化。内层一般为数层结构，纤维又比较致密，可以在一定程度上降低血液渗透性，支持内皮细胞的生长增殖，从而形成有功能性分区的组织工程血管。

图2 双层蛛丝蛋白血管支架的宏观形貌和微观结构 (a) 宏观形貌； (b) 横截面 (☆表示内层部位)；(c) 内层； (d) 外层Fig.2 Macro-morphology and microstructure of bilayer spider silk protein vascular scaffold. (a) Macro-morphology; (b) Cross section (☆indicates inner layer); (c) Inner layer; (d) Outer layer

2.2 大体观察

细胞在人工血管内表面的种植是构建组织工程血管的关键一步。人工血管支架能够促进细胞的黏附、生长和增殖，本研究制备的人工血管支架生物相容性好，内表面多孔的结构完全满足细胞黏附生长的要求。培养7 d后，大体上观察管状的组织工程血管有一定弹性，通畅性良好(见图3)。

图3 体外培养7 d后的组织工程血管 Fig.3 Tissue engineering blood vessel after culture in vitro for 7 days

2.3 扫描电镜观察

MSCs在血管支架中的生长可以通过SEM观察分析，当培养到第7 d时，细胞和支架表面紧密结合, 细胞能较好地黏附在血管支架上, 细胞触角之间彼此相接。细胞与血管支架纤维表现出很好的相容性，与纤维融合成为三维细胞网状结构，且将材料纤维大部分包埋。细胞在血管支架表面生长一周后可以形成较好的细胞层(见图4)。

图4 组织工程血管的扫描电镜观察Fig.4 SEM of tissue engineering blood vessel

2.4 HE染色观察

图5 组织工程血管的HE染色 (a)单独的血管支架；(b)细胞与血管支架复合培养Fig.5 HE staining of tissue engineering blood vessel (a) Vascular scaffold without cells; (b) Coculture of cells and vascular scaffold

切片HE染色能较好地体现细胞在支架材料中的分布和生长情况。在血管支架内部种植MSCs，1周后用HE染色观察细胞生长黏附和分布情况。从图5中可见，细胞与血管支架有良好的细胞相容性，MSCs能在血管支架表面黏附，并且可以迁移到血管支架纤维内部生长，存在于纤维间隙中。未种植细胞的支架材料中没有发现任何细胞。

2.5 组织工程血管的缝合强度

组织工程血管的缝合强度为(0.95±0.12)N/针，是天然血管的29.6%(见图6)。

图6 组织工程血管的缝合强度 (*P<0.05)Fig.6 Suture strength of tissue engineering blood vessel (*P<0.05)

2.6 DNA含量测定结果

根据表2分析，随着时间的持续，(pNSR16/PCL/CS)/(pNSR16/PCL/Gt)血管支架上的细胞DNA含量不断增加，并且与(PCL/CS)/(PCL/Gt)血管支架组在各个时间点都有统计学上的显著差异性。

表2 组织工程血管DNA含量(±s)(μg/mL)

注：*与对照组比较，P<0.05。正常血管的DNA含量为33 μg/mL

Note:*compared with control group,P<0.05. The DNA content in normal blood vessels is 33 μg/mL

2.7 羟脯氨酸含量测定

随着时间的持续，含有蛛丝蛋白的双层血管支架与间充质干细胞复合动态培养构建的组织工程血管中的羟脯氨酸的含量不断增加，在第14和28 d分别达到0.16 和0.2 μg/mg, 且与对照组相比在统计学上有显著性差异(见表3)。

表3 羟脯氨酸含量测定(±s)(μg/mg)

注：*与对照组比较，P<0.05

Note:*compared with control group,P<0.05

3 讨论

血管组织工程指应用组织工程的手段修复受损的血管，涉及到血管支架与种子细胞[4]。MSCs提取简单，增殖速度快，短期内可大量扩增，有多向分化性，同种异体移植未出现免疫排斥反应[5-6]。在体外构建组织工程血管具有实用性和可操作性，其构建过程是将种子细胞与血管支架复合培养，并经体外扩增，然后将细胞-血管支架的复合物移植到动物体内，在细胞外基质合成的同时，支架材料逐步被降解和吸收，最终只剩下没有异物的组织工程结构[7]。冉峰等[8]研究将MSCs与脱细胞血管支架复合培养用于构建组织工程血管，体内移植 3个月后，脱细胞血管支架组和组织工程血管组的血流通畅率分别为80%和90%，均比同种异体血管组(25%)高。HE染色和SEM观察表明，组织工程血管组出现内、中、外膜三层结构，形态与天然血管类似，内壁覆盖有较多的细胞。

将平滑肌细胞和内皮细胞种植到可降解的血管支架材料或脱细胞血管支架培养构建的组织工程血管上，后移植到动物体内后长期通透性不佳[9-11], 且平滑肌细胞和内皮细胞的增殖能力有限, 而成体干细胞增殖能力强且具有多向分化的潜能。MSCs是构建自体血管移植物的理想细胞来源, 通过简单的骨髓穿刺即可获得, 创伤小、安全性高。利用MSCs构建组织工程小直径血管并进行动物体内移植的研究较少, 大直径组织工程血管的研究相对较多。有研究证明在种植CD34+细胞后,能有效提高人工血管的内皮化程度。也有研究表明将MSCs种植到乳酸/乙酸共聚物 (PLGA) 复合培养后, 移植到裸鼠皮下经过一段时间可形成血管样组织, 并能够表达与血管平滑肌细胞(VSMCs) 相关的因子, 但与正常血管组织相比其结构还有一定的差异[12], 而将BMSCs接种到左旋聚乳酸(PLLA) 后再移植到犬下腔静脉, 经过一段时间可形成分层的血管组织, 在此过程中BMSCs也逐步被血管壁细胞所取代[13]。由此可见动态的培养环境对于构建组织工程血管非常重要。本研究中应用SD大鼠MSCs作为种子细胞，应用蛛丝蛋白复合材料血管支架作为血管支架，在体外应用动态培养的方法，研究构建组织工程化小直径血管的可行性。

体外构建组织工程血管时需要一定的微环境，其在组织工程血管的成熟过程中有着重要的作用[14-15]。血管支架与种子细胞复合物的培养方法有静态培养与动态培养两种。静态培养是将复合物置于细胞培养箱中培养，其环境通常是静止的, 无外界的力学刺激[16-17]。动态培养包括在动物体外模拟体内动态环境的培养和动物体内的培养，体外动态培养是通过应用剪切力与张力等力学因素, 产生类似血管搏动和血流冲涮的外界力，为在体外构建组织工程血管创造良好的微环境[18]。本研究通过简单在体外给与细胞支架复合物一定程度的力学刺激，使得培养基流动起来，从而产生类似体内动态环境的力学刺激。

观察细胞在支架上的形态可以评定组织工程血管的形成状况，细胞形态牵涉到功能的发挥, 反映了支架与细胞的相互作用关系，对细胞外基质的分泌和细胞分化产生重要的影响。假如细胞在支架上黏附较好, 表明支架的细胞相容性优良，能促进细胞的增殖。SEM与HE染色研究结果表明细胞能够在双层血管支架上较好地铺展扩增。通过测定形成的组织工程血管中的DNA含量来间接表征细胞的数量，从而在一定程度上反映组织工程血管的成熟程度[19]。文献[20]的研究表明天然血管的细胞DNA含量为33 μg/mL，在实验中，发现在培养28 d后，含有蛛丝蛋白血管支架上的细胞DNA含量可以达到32 μg/mL，基本上接近天然血管的数值，由此表明培养28 d后基本上可形成组织工程血管。

胶原纤维主要分布在软骨、血管、肌腱和皮肤等部位，是动物体内重要的细胞外基质成分。羟脯胺酸是胶原蛋白分解后的产物，其占胶原的比例是恒定的，所以测量羟脯氨酸含量可推测胶原的含量[21]。因此在本研究中可通过测定羟脯胺酸含量来初步判断新生组织工程血管中胶原的合成和分泌状况。细胞支架复合物培养28 d后，组织工程血管的羟脯氨酸的含量依然较低，分析认为一方面是由于培养时间较短，需要延长培养时间，另一方面是由于构建组织工程血管过程中，干细胞在逐步变成内皮细胞，其分泌胶原的能力与天然内皮细胞有较大差异。

天然血管处于一个长期动态的生理环境中，有利于形成较强的力学强度。对于管状的血管支架而言，静态培养显然无法让种子细胞与管状支架内腔面获得充分而均匀的接触，动态培养更加有利。将双层血管支架应用于组织工程血管构建时，由于支架纤维之间连接紧密，在无外界的动力刺激下，仅靠普通静态培养方式，细胞迁入纤维内部仍然还有困难。即使有限的细胞进入，由细胞分泌形成的细胞外基质存在不均匀分布现象，使得组织工程血管的生物力学性能依然低于天然血管。Nerurkar等的研究表明动态培养能显著提高细胞在支架纤维内部的迁移能力[22]。应用旋转种植的方式将犬骨髓MSCs种植到脱细胞基质上，应用动态生物反应器体外构建小直径组织工程血管文献[23]。结果表明动态种植的细胞能长入到基质内弹力纤维层，细胞伸展，排列方向与培养液流动方向一致；静态种植的细胞成片状排布，排列杂乱。在本研究中，囿于条件限制，主要采用体外简单动态培养，因此其构建的组织工程血管和正常的血管相比还有一定的差距。制备的组织工程血管的缝合强度较低，这是因为复合物处于简单且间断性的动态培养环境，并且动态刺激的时间相对较短，给与组织工程血管有效的生物力学刺激不足。动物来源的天然血管形成于动态的血液环境中，轴向张力与周向张力皆对其管壁功能的发挥产生影响。有研究证实这两种力会使血管壁细胞的排列方式、形态、增殖以及细胞外基质的分布状况发生改变[24]。因此在后续的研究中还有必要继续改进培养组织工程血管的动态培养条件，构建组织工程血管时采用动态血管生物反应器，从而创造一个更优良的动态培养环境。

4 结论

本研究应用动态培养的方法将干细胞与蛛丝蛋白双层小直径血管支架复合培养成功构建了组织工程血管，细胞能较好地铺满管状支架内壁，部分可迁移至血管支架纤维内部生长。获得的组织工程血管的缝合强度为(0.95±0.12)N/针，仅是天然血管的29.6%，因而有必要在后续研究中进一步提高其力学强度。组织工程血管中的羟脯氨酸含量和DNA含量随着培养时间的延长而不断增加，表明细胞增殖良好且能有效地分泌细胞外基质。在后续的研究中考虑将构建的组织工程血管用于小直径血管缺损的修复，探讨其修复效果，为其临床应用奠定参考基础。

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Research on the Construction of Small Diameter Tissue Engineering Blood Vessel Based on Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Spider Silk Protein Vascular Scaffold

Zhao Liang1,2Xu Yanli1He Meng1Li Min1

1(CollegeofLifeSciences,FujianNormalUniversity,Fuzhou350108,China)2(CollegeofLifeSciencesandTechnology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,Henan,China)

In this work, bone marrow mesenchymal stem cells and spider silk protein vascular scaffolds were compositely cultured to construct small diameter tissue engineering blood vessel under the dynamic condition, aiming to provide new source of vascular grafts for treatment of cardiovascular disease. Mesenchymal stem cells were cultivated onto the lumen of tubular vascular scaffold under the dynamic culture condition. By means of scanning electronic microscope, HE stain, suture strength test, DNA content detection and hydroxyproline index determination, the formation degree of tissue engineering blood vessel was evaluated. After cultured for 7 days, cells not only fully spread out on the surface of nanofibrous scaffold, but also migrated into fiber interior, showing the vascular scaffold good compatibility. Suture strength of tissue engineering blood vessel was 0.95±0.12 N, which was 29.6% of natural blood vessels. The DNA and hydroxyproline content in the tissue engineering blood vessel continually increased over time, and hydroxyproline content on the day 14 and 28 reached 0.16 and 0.2 μg/mg respectively, which had significant difference in statistics compared with control group. A kind of small diameter tissue engineering blood vessel was successfully constructed with ideal indexes, which laid foundation for its clinical application.

spider silk protein; tissue engineering blood vessel; marrow mesenchymal stem cells(MSCs); suture strength

10.3969/j.issn.0258-8021. 2015. 01.010

2014-03-18， 录用日期:2014-09-26

福建省科技厅重点项目(2010Y0020); 国家级大学生创新创业训练计划(201310394011)

R318.5

A

0258-8021(2015) 01-0070-07

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: mli@fjnu.edu.cn