马玉梅，冯若飞，2，李　倬*

(1. 甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；

2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030)

牛疱疹病毒1型检测技术及疫苗研究进展

马玉梅1，冯若飞1，2，李倬1*

(1. 甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；

2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030)

[摘要]牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是由牛疱疹病毒I型( Bovine herpes virus-1, BHV-1)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病.该病毒的危害性在于病毒侵入牛机体后，潜伏在一些特定的部位，致使病毒持续性感染，病牛长期甚至终身带毒，给控制和消灭本病带来很大困难，给全球养牛业造成了重大经济损失.文章就BHV-1分子生物学、诊断及各类疫苗进行阐述，旨在为该病的进一步研究提供理论参考.

[关键词]牛疱疹病毒I型；检测技术；疫苗研究

牛疱疹病毒I型( Bovine herpes virus-1,BHV-1)，又称牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)，它是全球公认的牛传染性鼻气管炎(IBR)的致病因子，它具有典型的泛嗜性，能感染多种器官和组织，并且具有多种临床症状.该病表现为呼吸道黏膜及气管黏膜发炎、呼吸困难、结膜炎、脑膜炎，使怀孕母牛流产，还可引起母牛传染性脓疤性外阴阴道炎(IPV)、公牛传染性脓疤性龟头包皮炎(IPB).该病毒也与中枢神经紊乱有关[1,2].美国于1955年首次报导了该病，1956年Madin第一次从病牛中分离到BHV-1.我国是在20世纪80年代初由周泰冲等首次从新西兰进口奶牛中分离得到该病毒[3].BHV-1主要感染的宿主为牛，其中较为多见的是肉牛，其次是奶牛，又以20~60日龄的犊牛最为易感.据报道，本病毒能使山羊、猪和鹿感染发病[4].目前，我国大多数省市和地区的各类牛群中也有此病毒感染，且呈现上升趋势，对牛群育肥率、产奶量和繁殖率产生了严重影响，一定程度上阻碍了养牛业的发展，也对我国动物和动物产品的国际贸易带来不良影响.

1BHV-1分子生物学特征

1964年Huck确认BHV-1属于疱疹病毒，属a-疱疹病毒亚科，水痘病毒属,球形有囊膜病毒.该病毒成熟的病毒粒子直径约为150 nm~220 nm，核衣壳为二十面体，直径约80 nm~ll0 nm，表面有162个壳粒.牛疱疹病毒1型的抵抗力较强，在pH 4.5~5.0时不稳定，pH 6.0~9.0时稳定，在pH 7.0的细胞培养液内最稳定.BHV-1对温度十分敏感，37 ℃时，经10 h左右即死亡一半，56 ℃经21 min即可灭活.22 ℃保存5天，BHV-1毒价可下降到1/10；4 ℃以下保存30天，其毒价几乎不变；-70 ℃可保存数年.该病毒对胰蛋白酶、酸性和碱性磷脂酶等较敏感，对有机溶剂氯仿、酚类、甲醛亦敏感[5].

BHV-1基因组为双股线性DNA分子，基因组全长约为137 kb，其中鸟嘌呤和胞嘧啶(G+C)的含量高达72%，由一个长独特区(UL)和一个短独特区(US)序列构成.US区一端是内部重复序列(IR)，另一端是外部重复序列(TR).1995年，完成了对BHV-1的基因组测序[6].BHV-1的所有基因可以分成两大类：非必需基因和必需基因.病毒缺失了某些基因以后仍然可以在体外增殖，这些基因就被称为非必需基因.反之，若缺失了某些基因后可引起致死性突变的基因，则被称为必需基因.BHV-1基因组编码的约70个基因中有30%以上的基因在病毒增殖中是非必需的[5].BHV-1基因编码很多种蛋白，包括与核酸代谢、DNA合成以及蛋白组装有关的蛋白[7].BHV-1基因编码约33种结构蛋白[8]，其中13种为囊膜蛋白[9]，10种为糖蛋白[10].目前已知的糖蛋白有gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK和gL，主要囊膜糖蛋白为gB、gC和gD.其中UL区编码了6种糖蛋白分别是：gK (UL53)、gC (UL44)、gB (UL27)、gH (UL22)、gM(UL10)、gL(UL1)；US区编码了gG (UL4)、gD (UL6)、gI (US7)和gE (US8)4个糖蛋白.研究表明，gB、gC、gD等糖蛋白与病毒吸附宿主细胞以及病毒在细胞间扩散有关，其中gB、gC、gD是引起宿主免疫应答的主要抗原，gD能诱导最高水平的体液和细胞免疫反应[11,12]，编码gC, gD, gE, gG, gl, UL49h以及胸腺激酶(TK)的基因与病毒毒力有关[13-20].gE 的存在对病毒有效地感染中枢神经系统方面有重要作用，gE是病毒复制非必需的，这有望成功研制基因缺失疫苗.缺失gE特定部位的编码区能降低疫苗的毒力并能抗病毒地入侵.薛飞等[21]研究表明，gE 可用于建立ELI SA 诊断方法.

2BHV-1诊断技术

牛传染性鼻气管炎IBR可结合临床症状、病理变化和流行病学作出初步诊断，但确诊需依靠实验室检查.IBR 的实验室诊断方法主要包括病毒分离鉴定、免疫组织化学检测以及血清学和分子生物学技术等.

2.1　病毒分离鉴定

牛肾或睾丸的单层细胞、牛肾传代细胞(MDBK)和牛气管传代细胞(BTC)均可用于BHV-1分离.将待检样品接种到上述敏感细胞后，每天观察病变情况，该病毒的细胞致病性来得快，正常情况下接种后3～5天内产生细胞病变效应(CPE).开始呈局灶性细胞变圆、变暗，聚集成葡萄样群落，在向四周扩散的同时，中心部细胞逐渐脱落，3～4天后细胞单层基本脱光.若7天仍不出现细胞病变，应再盲传两次，将培养物经过反复冻融后离心去除细胞碎片，取上清接种于新的单层细胞做进一步病毒分离.

牛传染性鼻气管炎病毒只有一个血清型，只要有一个已知标准毒株的免疫血清，然后在敏感细胞培养物上进行中和试验，就可作出鉴定.

2.2　病毒抗原检测方法

Terpstra等以直接荧光抗体法检查病牛的鼻液涂片，结果全部人工感染牛均于接种后2～7天检出了病毒抗原[22].免疫酶实验和放射免疫测定等方法[23]也可用于病毒抗原的检测.这些方法的主要缺点是敏感性低、耗时耗力且受不确定因素的影响.

2.3　病毒特异性抗体检测方法

中和试验、琼脂扩散试验、间接血凝试验及酶联免疫吸附试验(ELISA)均能检测牛血清中牛传染性鼻气管炎抗体.由于BHV-1有潜伏感染的特性，因此，即使牛群血清抗体阴性，仍难以保证牛群就没有BHV-1感染.ELISA 比中和试验操作简单、快速，不需要细胞培养设备，比中和试验敏感，适合大量样品检测等优点，适用于一般实验室，是较常用的血清学方法.Suresh[23]报道了用免疫扩散和对流免疫扩散检测 BHV-1 的方法.据陈天祥等(1987)报道[24]，间接血凝试验(IHA)对本病是一种简单、快速、准确的血清学诊断方法.

2.4　分子生物学诊断方法

聚合酶链式反应(PCR)方法，1993年Engelenburg等[25]用于IBR的检测.Rocha MA 等[26～28]在1998年建立了高度敏感的巢式聚合酶链式反应( Nest-Polymerase chain reaction PCR) 检测BHV-1 ,能够检测10-3TCID50/50 μL的细胞上清液.PCR后，接着进行脱氧核糖核酸杂交(Southern blotting)试验是检测BHV -1 DNA 的最敏感的方法[29].陈茹等[30]采用LUX新型荧光PCR建立了快速检测牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)以及鉴别野毒感染和基因缺失疫苗免疫动物的二重实时荧光PCR方法.本方法全程仅需约2 h，双基因鉴别检测的敏感性可达1 TCID50以上，可应用于临床快速检测BHV-1病毒.目前，PCR已经是检测IBR的一种特异性强、快速、准确、常规的方法且被广泛应用.

近年来，核酸探针已被广泛应用于病毒检测，核酸探针检测的阳性结果能确定是BHV-1阳性牛的判断标准，为流行病学调查和临床诊断提供了依据.吴时友等[31]从纯化的BHV-1提取全基因DNA，用32P 标记作为探针，进行点杂交.试验结果表明，该探针可检出10 pg的BHV-1 DNA，能明显区别BHV-1感染细胞和未感染细胞，具有很高的灵敏度和特异性.随后用生物素代替32P 制备探针，也取得相同结果.同位素标记的探针可以在-20 ℃保存1年以上，有利于推广应用，又可弥补放射性同位素探针半衰期短及对人体健康有害的弊端[32].

3疫苗研究

3.1　常规疫苗

常用的常规疫苗有灭活苗和减毒或无毒活苗两类.有些学者认为灭活苗在灭活前的病毒的滴度必须达到106.5PFU，低于此抗原浓度容易引起免疫失败，而且不能保护强毒的攻击.1956 年BHV- 1首次被分离后，同年就报道了第1株减毒疫苗，至今，已有十多种代表不同毒株的IBR弱毒疫苗用于牛的预防接种.弱毒苗的优点是产生免疫效应快，接种2～3天后由于鼻分泌物中干扰素的作用即可防止感染.另外，其安全性好，不引起流产.弱毒苗的广泛使用的确降低了本病的发病率，减少了经济损失.但已有不少报道接种疫苗后并没有保护牛免于IBR病毒引起的呼吸道疾病以及与BHV-1有关的结膜炎.另外，给自然带毒牛进行疫苗接种也不能阻止其排毒，其潜伏感染可能引起接种动物的免疫抑制，导致对其他感染的易感性增加或对其他疫苗的反应性降低，且疫苗株在牛群之间传播时能引起毒力返强，从而使免疫牛群成为该病潜在的传染源，因此，有些国家已不再使用.传统疫苗最大缺点是由于疫苗株和野毒株之间的交叉反应性，接种后无法鉴别接种牛和野毒感染牛.由此可见，长期使用常规疫苗(包括灭活苗和弱毒苗)不利于联合接种和本病的根除[32].

3.2　亚单位疫苗

BHV- 1的糖蛋白gB、gC、gD都能诱发中和抗体，该抗体能阻碍病毒的体外感染和体内复制.尤其根据gD在病毒早期感染阶段所产生的作用及作为产生中和抗体的主要靶蛋白而被认为是潜在的亚单位疫苗的候选蛋白.由于不含病毒的核酸物质而安全有效且不存在潜伏感染的危险，但因其不能在体内复制，所需接种量大，成本也高，因而至今未得到广泛使用.

3.3　基因工程缺失苗

现已发现BHV-1基因组中包含TK、gC、gE等病毒复制非必需基因，成为构建基因缺失疫苗的缺失对象.目前已有多个单基因、双基因乃至三基因缺失苗问世.BHV-1 TK基因缺失苗采用各种免疫接种方式均无致病性，标记疫苗接种后能有效地保护牛，再用其鉴别诊断试剂盒检验能使自然感染牛和接种牛区别开来，其缺点是疫苗病毒具有潜伏性.gE基因缺失苗免疫牛可产生早期的免疫应答，在IBR爆发早期使用可有效地预防BHV-1流行，gE基因缺失疫苗十分适合BHV-1的防治和根除[33].

3.4　病毒活载体重组疫苗

随着第一代基因缺失疫苗的开发使用，第二代基因缺失活载体疫苗正在研制和开发之中[34].此疫苗能同时启动机体细胞免疫和体液免疫，避免了灭活苗的缺陷，又无常规活苗毒力反祖之虞，更重要的是活载体苗可同时构成多价和多联苗.关于BHV-1的活载体疫苗国外学者早有报道，但是绝大多数还处于实验室研究阶段，国内学者李继昌已经成功构建表达牛流行热病毒( Bovine ephemeral fever virus ,BEFV) G 基因的牛传染性鼻气管炎病毒转移载体[35,36]，为开发BEFV/BHV- 1二联基因工程疫苗奠定了基础[37].

4展望

随着我国规模化养殖业的发展，尽快启动牛的重大疾病的根除或控制计划势在必行.科学技术的进步，对该病的诊断方法在不断的完善，快速、有效、敏感的诊断方法在临床上得到了广泛的应用.相信不久的将来，随着多基因缺失苗和病毒活载体重组苗的成功研制，根除牛传染性鼻气管炎的计划将成为现实.

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Progress on Detection Technology and Vaccines Preparation of Bovine Herpes Virus-1

MA Yu-mei1, FENG Ruo-fei1,2，LI Zhuo1*

(1. Animal cell Engineering&Technology Research Center of Gansu, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China; 2. Key Bio-engineering and Technology Laboratory of SEAC, Northwest University For Nationalities, Lanzhou 730030, China)

[Abstract]Infectious bovine rhinotracheitis( IBR), caused by Bovine herpes virus-1, was an acute, thermal and contagious infectious diseases. The dangers of the viruses lurked in the certain special locations, resulted in persistent infection for a long-term or even a lifelong infection in cows after the virus invaded the body of cattle. The control and eradication of the disease had many difficulties, which caused the significant economic losses in the cattle industry over world. This article reviewed the BHV-1 molecular biology, diagnosis and various vaccines. It aimed at providing the theoretical reference of further research diseases.

[Key words]Bovine herpes virus-1; Detection technology; Vaccines

[作者简介]马玉梅(1988—)，女，甘肃临夏人，硕士研究生，主要从事人兽共患病预防诊断技术方面的研究.

[通讯作者]*

[基金项目]教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目(IRT13091)，西北民族大学横向合作项目(XBMU-2014-BC-18).

[收稿日期]2015-08-02

[中图分类号]Q342+.4；S852.5

[文献标识码]A

[文章编号]1009-2102(2015)03-0042-05