王 静， 孔凡玉， 陈晓红， 田 华，3

（1.中国烟草总公司青州烟草研究所烟草行业烟草病虫害监测及综合治理重点实验室，青岛 266101；2.山东临沂烟草有限公司沂南分公司，临沂 276300；3.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

短小芽胞杆菌AR03对烟草炭疽病的抑制作用

王 静1， 孔凡玉1， 陈晓红2， 田 华1，3

（1.中国烟草总公司青州烟草研究所烟草行业烟草病虫害监测及综合治理重点实验室，青岛 266101；2.山东临沂烟草有限公司沂南分公司，临沂 276300；3.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

为测定短小芽胞杆菌AR03菌株对烟草炭疽病菌的室内拮抗活性和盆栽防治效果，采用平板拮抗法初步筛选菌株拮抗活性，采用抑制菌丝生长法及抑制孢子萌发法筛选该菌株菌悬液的抑菌浓度，采用喷雾法进行防治效果测定。AR03菌株对烟草炭疽病菌的拮抗活性很强，能显著抑制菌丝生长、孢子萌发和病害发生，浓度为1× 107cfu/mL的AR03发酵液能有效抑制菌丝的生长和孢子萌发，AR03菌悬液（1×108cfu/mL）对炭疽病的盆栽防治效果为83.03%，与对照药剂25%三唑酮可湿性粉剂的防治效果相当。AR03菌株是一株优良的广谱高效生防菌株。

短小芽胞杆菌； 烟草； 植物促生细菌； 生物防治

烟草炭疽病是烟草的主要叶部病害之一，其病原为毁灭炭疽病菌（Colletotrichum destructivum）［1-2］，此病在烟草各生育期皆可发生，但以苗期普遍发生，尤其是烟区集约化育苗过程中发生更为普遍，病害严重时往往整片烟苗毁坏，烟草的产量和质量严重下降［3］。目前对该病害的防治主要是利用化学药剂，但化学药剂的使用对烟叶及环境均存在一定安全隐患，随着化学农药的使用量和应用范围被限制，采取其他有效防治措施对该病害进行综合防治，已成为一种必然趋势，其中生物防治逐渐成为防治植物病害的研究热点。利用拮抗微生物控制烟草炭疽病对烟草产业的可持续发展具有重要的意义。国内外关于烟草炭疽病生物防治的研究还比较少，万秀清等从400份烟草根际细菌中筛选获得1株含DAPG（2，4-二乙酰基藤黄酚）和PCA（吩嗪-1-羧酸），并对烟草炭疽病菌具有明显拮抗作用的荧光假单胞杆菌［4］。植物促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）对植物的有益作用主要表现在防病和刺激生长两个方面，对病害的防治机制包括拮抗、竞争、寄生等多种方式，刺激作物生长主要通过细菌产生植物激素，这些激素对微生物生长是必需的，同时也能对其生活环境中的其他生物具有促进生长的作用［5］。短小芽胞杆菌AR03（ZL201110146683.8）是本实验室分离的一株具有广谱抑菌作用的PGPR菌株［6］，该菌株对烟草具有促生效应，且对青枯病和黑胫病具有很好的防治效果［7-8］，本研究进一步测定了该菌株对烟草炭疽病菌的拮抗活性、抑菌浓度及其发酵液对炭疽病的盆栽防治效果，为烟草炭疽病生物防治提供高效且广谱抗菌的新菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）供试菌株与植物：AR03菌株，由本实验室分离保存（20%甘油、－20℃）。炭疽病菌TJ1（Colletotrichum destructivumO’Gara），分离自山东诸城；供试烟草品种为‘NC89’。

（2）培养基：常规的NA与NB培养基用于培养AR03菌株；PDA培养基用于培养炭疽病菌TJ1，培养基配方参照文献［8］制备。

（3）对照药剂：25%三唑酮可湿性粉剂（昆明云大科技农化有限公司产品）。

1.2 方法

1.2.1 AR03及其发酵液对TJ1的拮抗活性

接种AR03于NA平板上28℃培养48 h，然后采用平板对峙法，即在PDA平板的中心接种TJ1菌株的菌饼（直径为5 mm），用接种环蘸取AR03于菌饼两边等距离画线，置于28℃培养5 d，观察TJ1菌株的生长情况。将活化的AR03接种于NB培养液中，28℃、120 r/min振荡培养48 h得到其发酵原液（浓度为4×1011cfu/mL），取200μL发酵液与20 mL PDA于培养皿内混合均匀，将TJ1菌饼置于平板中央，于28℃培养5 d，观察TJ1菌株的生长情况。

1.2.2 AR03发酵液对TJ1菌丝生长的影响

将发酵原液进行梯度稀释，获得1×107、1× 106、1×105cfu/mL 3个浓度。采用菌落直径法，分别取上述3个浓度的发酵液200μL与20 mL熔化的PDA培养基混匀，倒入培养皿内制成含菌平板，将TJ1菌株的菌饼（5 mm）置于平板中央，以空白的LB液体培养基为对照，28℃培养7 d后，测量菌落直径，并挑取处理后病原菌菌丝进行镜检（尼康E100型显微镜）。

1.2.3 AR03发酵液对TJ1孢子萌发的影响

首先制备TJ1孢子悬浮液，移液枪吸取适量无菌水反复冲洗吹打PDA平板上的TJ1菌落，洗下的孢子和菌丝经3层无菌纱布过滤，即得到一定浓度的孢子悬浮液，血球计数板计数后，用无菌水进行梯度稀释，将悬浮液浓度调整为1×105个/mL。将上述3个浓度的发酵液与孢子悬浮液各70μL混合滴于带有凹槽的载玻片上，26℃、100%湿度条件下放置10 h后镜检观察孢子萌发情况。

1.2.4 AR03对烟草炭疽病的盆栽防治效果

AR03发酵液参照1.2.1所述方法制备，10 000 r/ min离心10 min，去上清，收集菌体，蒸馏水稀释菌体至浓度为1×108cfu/mL，对4片真叶的烟苗进行整株喷雾，每处理8株烟苗，3次重复。间隔7 d，第2次喷施AR03菌悬液6 h后，均匀喷施浓度为1×105个/ mL的TJ1孢子悬浮液，药剂对照采用25%三唑酮可湿性粉剂500倍喷雾，另设清水处理为空白对照。将上述处理置于密闭环境中保湿48 h后，按照常规温室管理，第9天调查发病率及发病严重度，严重度分级按照烟草病害分级及调查方法（GB/T 23222 2008）；发病率、病情指数及防效用DPS数据处理系统进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 AR03菌株及其发酵液的拮抗活性

平板对峙培养的结果（图1）显示，AR03菌株对炭疽病菌TJ1具有较好的抑菌效果，表现为对病原菌菌落扩展具有显著的抑制作用，TJ1菌落的边缘及与抑菌带接触的菌丝变枯萎、稀疏，并停止生长。混菌平板的抑制效果亦很明显，TJ1菌丝几乎未见生长。

图1 AR03菌株对TJ1的拮抗活性Fig.1 Inhibitory activity of strain AR03 against TJ1

2.2 AR03发酵液对TJ1菌丝生长的影响

试验结果如表1所示，供试3个浓度的AR03发酵液均能不同程度地抑制TJ1菌落的生长，处理后的菌落生长缓慢、菌丝颜色变深且稀疏，随着浓度的增大，抑制率增强，其中以1×107与1×106cfu/ mL浓度的抑制效果较好，分别为92.93%和87.19%，而1×105cfu/mL浓度的抑制效果仅为50.54%；镜检结果显示，与对照（图2a）相比，经AR03处理过的菌丝变粗、呈弯曲状，隔膜之间的菌丝缩短、膨大，其内的原生质浓缩聚集，严重变形的菌丝还盘结成团（图2b），从而不能正常生长；而对照的菌丝生长正常。

图2 AR03发酵液对TJ1菌丝形态的影响Fig.2 Inhibitory effects of AR03 fermentation broth on the hyphae morphology ofC.destructivum

2.3 AR03发酵液对TJ1孢子萌发的影响

结果如表2、图3显示，拮抗细菌AR03的发酵液在1×107、1×106和1×105cfu/m L浓度均能抑制炭疽病菌TJ1孢子的萌发，随着浓度的减小，抑制率减弱，处理10 h后，以1×107cfu/mL浓度抑制孢子萌发的作用最强，孢子萌发率仅为12.17%，抑制率达到86.36%。经镜检观察，TJ1菌株的孢子经AR03发酵液处理后，不能萌发的孢子严重畸形，膨大变粗，棒形孢子两端变突出，呈钝圆形（图3b，c），孢子萌发产生的芽管生长点膨大呈钝圆状、致畸，生长缓慢，失去进一步发育为菌丝体的能力，而对照的孢子萌发正常（图3a）。

表1 不同浓度AR03发酵液对TJ1菌落生长的抑制作用Table 1 The inhibitory effects of AR03 fermentation broth at different concentrations on the colony growth ofC.destructivum

2.4 AR03菌悬液对烟草炭疽病的温室防治效果

AR03菌悬液喷雾处理对烟草炭疽病的抑制试验结果（表3）表明，接种后第9天，AR03菌悬液的防病效果为83.03%，25%三唑酮可湿性粉剂处理的防病效果为80.17%，即AR03菌株处理的防效略高于化学药剂处理，但2个处理在0.05水平上差异不显著。并且AR03菌株对烟草具有明显的促生作用，表现为地上部的烟株叶片增大，叶色浓绿，生长势强。

图3 AR03发酵液对TJ1孢子萌发的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of AR03 fermentation broth on the spore germination ofC.destructivum

表2 不同浓度拮抗细菌AR03发酵液对TJ1孢子萌发的抑制作用1）Table 2 The inhibitory effects of AR03 fermentation broth at different concentrations on the spore germination ofC.destructivum

表3 AR03菌悬液对烟草炭疽病的抑制效果Table 3 The control effects of bacterial suspension of AR03 on tobacco anthracnose

3 讨论

烟草是叶用经济作物，而烟草炭疽病是危害烟草苗期的重要叶斑类病害，在实际生产中一般采用化学药剂防治，化学药剂的大量使用会造成抗药性和环境污染等一系列问题，经济、安全、有效的生物防治措施越来越受到人们的重视。国内关于短小芽胞杆菌用于植物病害生物防治已有报道［10-11］，但用于烟草炭疽病的生物防治尚未见报道。

本研究的结果表明，AR03菌株及其发酵液对烟草炭疽病菌菌丝、孢子萌发均具有较好的抑制作用，平板试验显示，浓度为1×107cfu/mL的AR03发酵液能较好地抑制烟草炭疽病菌菌丝生长和孢子萌发。对菌丝的作用表现为菌丝膨大、隔间缩短，菌丝内原生质聚集，菌丝弯曲聚集成团；对孢子萌发的抑制作用表现为孢子萌发率降低，且孢子畸形，膨大、变形，萌发的孢子产生的芽管生长点膨大呈钝圆状、畸形，生长缓慢，失去进一步发育为菌丝体的能力。AR03菌悬液对炭疽病的盆栽防效较好，与化学药剂25%三唑酮可湿性粉剂防效相当，显示出其作为生物农药的潜力。

迄今为止，已有许多关于PGPR用于植物病害的防治和促进植株生长的报道，PGPR菌株对植物的有益作用主要表现在防病和刺激生长两个方面，PGPR能够通过提高出苗率，促进幼苗早期快速生长，从而有效防治猝倒、立枯及根腐等作物早期的病害，PGPR的利用已成为植物病害生物防治的重要内容［12-14］。短小芽胞杆菌作为土壤植物根际重要的PGPR菌群之一，其用于植物病害的生防潜能已经被许多试验研究证实，目前国外主要将短小芽胞杆菌应用于防治蔬菜的根际病害，Akhtar等［15］报道短小芽胞杆菌用于防治鹰嘴豆根腐病有较好的防治效果；黄静文等［16］从烤烟叶面上分离筛选得到1株短小芽胞杆菌Van35（Bacillus pumilus35），经该菌株处理烟丝后，能明显提调烟香、细腻醇和烟气、降低刺激性、掩盖杂气和改善卷烟吸味的效果。短小芽胞杆菌AR03是本实验室分离的1株PGPR菌株，该菌株已获得发明专利，其不但对烟草主要根茎病害如黑胫病和青枯病具有较好的防效，而且对重要叶斑病害包括炭疽病和赤星病（另文报道）的抑制作用也较强。可能是该菌株分泌广谱的抗生物质，从而对烟草多种病害起到抑制作用，同时促进植物生长。该菌耐贮存，抗逆性好，重新引入环境中不会导致环境污染，具有很好的开发前景。但该菌株的抗病、促生机制尚不清楚；且温室环境与田间存在较大差异，因此本研究的短小芽胞杆菌AR03菌株在田间的防治效果及使用方法还有待于进一步研究。

［1］ 贾玉，郑翠梅，张广民，等.山东烟草炭疽病菌病原鉴定及其分子检测［J］.山东农业科学，2012，44（4）：10 14.

［2］ 田华，王静，赵杰，等.一株烟草炭疽病病原菌的鉴定和生物学特性研究［C］∥吴孔明.中国植物保护学会2012学术年会论文集植保科技创新与现代农业建设.北京：中国农业科学技术出版社，2012：78 81.

［3］ 朱贤朝，王彦亭，王智发.中国烟草病害［M］.北京：中国农业出版社，2002.

［4］ 万秀清，郭兆奎，颜培强，等.烟草炭疽病拮抗生防菌的筛选［J］.微生物学通报，2008，35（11）：1727 1731.

［5］ 张霞，唐文华，张力群.枯草芽孢杆菌B931防治植物病害和促进植物生长的作用［J］.作物学报，2007，33（2）：236 241.

［6］ 王静，孔凡玉，赵廷昌，等.拮抗细菌AR03在烟草根部及根际土壤中的定殖与鉴定［J］.中国烟草科学，2010，31（3）：45 48.

［7］ 王静，赵廷昌，孔凡玉，等.拮抗细菌对烟草青枯病的防治效果和促生作用［J］.植物保护，2007，33（5）：103 106.

［8］ 王静，孔凡玉，秦西云，等.短小芽孢杆菌AR03对烟草黑胫病菌的拮抗活性及其田间防效［J］.中国烟草学报，2010，16（5）：78 81.

［9］ 方中达.植病研究方法［M］.北京：中国农业出版社，1998.

［10］于婷，尚玉珂，李艳芳，等.短小芽孢杆菌BSH 4抗菌物质的提取及其特性［J］.植物保护学报，2009，36（1）：65 69.

［11］程丹丹.水稻纹枯病生防潜力菌株短小芽孢杆菌223的初步研究［D］.杭州：浙江大学，2008.

［12］Raupach GS，Kloepper J W.Mixtures of plant growth-promotingRhizobacteriaenhance biological control of multiple cucumber pathogens［J］.Phytopathology，1998，88：1158 1164.

［13］和凤美，何月秋，唐文华，等.生防菌B9601对促进植物生长作用的研究［J］.中国农学通报，2002，18（4）：62 64.

［14］易龙，马冠华，肖崇刚.烟草生防益菌对烟草幼苗的促生效应研究［J］.中国农学通报，2006，22（2）：331 333.

［15］Akhtar M S，Siddiqui Z A.Glomusintraradices，Pseudomonas alcaligenes，andBacillus pumilus：effective agents for the control of root rot disease complex of chickpea（Cicer arietinumL.）［J］.Journal of General Plant Pathology，2008，74（1）：53 60.

［16］黄静文，段焰青，者为，等.短小芽孢杆菌改善烟叶品质的研究［J］.烟草科技，2010（8）：61 64.

The inhibitory effect ofBacillus pumilusAR03 against tobacco anthracnose

Wang Jing1， Kong Fanyu1， Chen Xiaohong2， Tian Hua1，3
（1.Key Laboratory of Tobacco Pest Monitoring，Controlling&Integrated Management，Qingzhou Tobacco Research
Institute of China National Tobacco Corp，Qingdao266101，China；2.Yinan Tobacco Company of
Shandong Linyi Tobacco Co.，Ltd.，Linyi276300，China；3.Graduate School of Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Beijing100081，China）

The inhibitory effects ofBacillus pumilusAR03 strain on tobacco anthracnose（Colletotrichum destructivum）were evaluated by culture assay and pot experiments in this study.The results showed that the AR03 strain had a good inhibitory effect onC.destructivumin both culture assay and pot experiments.The fermentation broth of AR03（1×107cfu/mL）could significantly inhibit the mycelium growth and spore germination.Pot test effect of AR03 bacterial suspension（1×108cfu/mL）was 83.03%，well matched with the protective effect of 25%triadimefon WP.The strain AR03 is a broad-spectrum，and efficient biocontrol strain.

Bacillus pumilus； tobacco； PGPR； biocontrol

S 482.292

A

10.3969/j.issn.0529 1542.2015.01.020

2013 11 14

2014 08 18

中国烟草总公司重点项目（110200902065）；四川省烟草专卖局项目（201003013）

联系方式 wangjing06@caas.cn