刘军明，敖杰男

1.广东省中西医结合医院，广东 佛山 528200；2.暨南大学医学院，广东 广州 510632

◆实验研究论著◆

心脉通颗粒含药血清对心肌细胞氧化损伤的保护作用

刘军明1，2，敖杰男2

1.广东省中西医结合医院，广东 佛山 528200；2.暨南大学医学院，广东 广州 510632

目的：观察中药心脉通颗粒含药血清对原代培养大鼠心肌细胞H2O2损伤的抗氧化作用。方法：原代培养的大鼠心肌细胞分为3组，正常对照组用正常大鼠血清培养，模型组用正常大鼠血清培养后，H2O2造损伤模型。心脉通组用心脉通含药血清干预12 h后，再加H2O2造损伤。各组分别在H2O2作用6h后检测实验中各指标：心肌细胞形态学的改变；MTT法检测细胞活性的改变；细胞免疫组织化学法检测蛋白激酶B（PKB/Akt）的表达；RT-PCR检测蛋白激酶B（PKB/Akt）和内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）的基因表达变化。结果：各组心肌细胞在H2O2作用下活力下降，与正常对照组比较，模型组细胞活力显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），表明H2O2损伤模型建立成功；心脉通组细胞活力高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。在正常状态下PKB的转录水平较低，模型组有所升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。且心脉通组的转录水平更高，与正常对照组和模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。正常情况下eNOS有表达，且表达水平是最高的。模型组中表达降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。心脉通组转录水平较模型组水平增高（P＜0.05）。结论：中药复方心脉通颗粒能够增强心肌细胞抗氧化损伤能力，保持细胞的形态和功能，抑制细胞调亡，其机制可能是通过PKB/AKT-eNOS信号传导途径。

心肌缺血；心肌细胞；心脉通颗粒；蛋白激酶B（PKB/Akt）；内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）

缺血性心脏病以及血管再通后的再灌注损伤，都可以导致细胞大量凋亡甚至死亡，严重影响心脏功能和病人的预后。心脉通中药复方为临床验证行之有效的方剂，但是其作用机理还不清楚，现通过用H2O2对心肌细胞进行损伤来模拟心肌缺血的状态，初步探讨中药复方心脉通颗粒对缺血心肌的保护作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器 DMEM高糖培养基(GIBCO公司)，胰酶(Amresco)，PBS缓冲液，胎牛血清(杭州四季清公司)；冷冻离心机(德国Heraeus公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；CO2恒温培养箱(美国FORMA公司)；正立电动荧光显微镜DMRA2(德国徕卡仪器有限公司)；RNA提取试剂(天根生化科技有限公司)；梯度PCR仪PC-808(日本AXTEC公司)；TakaRa RNA PCR Kit Ver3.0(大连宝生物工程有限公司)；微型电泳仪、BIO-RAD凝胶成象及分析系统。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清的获取 SD大鼠，200～250 g，共50只(南方医科大学实验动物中心)，雌雄各半随机分成2组，每组25只；分生理盐水灌胃组和中药复方心脉通灌胃组；给药剂量=临床常用量(每天3次，每次2料)×动物等效剂量系数(0.018) (按体表面积算)×培养基内稀释度(5倍)；每天给药2次，早晚各一次，连续2周；于末次给药后1～2 h腹主动脉取血，每只鼠大概取5 mL血液，1500 r/min(半径5 cm)离心取上层血清，60℃灭活30 min，-20℃保存。

1.2.2 心肌细胞原代培养及鉴定 取刚出生1～3天SD大鼠的乳鼠5只(购于南方医科大学实验动物中心)。超净台下，酒精全身消毒，剪开胸腔迅速取出心脏置于预冷的PBS中，洗去血液。均匀剪碎至1 mm3小组织块，采用逐次胰酶消化法获取大量单个心肌细胞悬液，培养基终止消化，1000 r/min(半径5 cm)离心后将细胞与5 mL培养基混合成细胞悬液，差速贴壁1 h后，接种于6孔板中，24 h换新鲜培养液一次，培养时间为3～5天(本实验室实验证实这时心肌细胞活力最好)。免疫细胞化学鉴定心肌细胞的纯度。

1.2.3 H2O2损伤模型的建立及实验分组 接上述方法培养的心肌细胞，分为正常对照组(DMEM+细胞+无药大鼠血清)、模型组(DMEM+细胞+无药大鼠血清＋H2O2)、心脉通组(DMEM+细胞+含药大鼠血清＋H2O2)。第2天各组加入15%血清，其它组不加，12 h后，在相应组加H2O2，使终浓度达到400 μmol/L[1]，H2O2损伤6～8 h后，常规倒置显微镜下观察细胞形态，取细胞做指标检测。

1.3 心肌细胞活力检测 原代心肌细胞培养3天(生长接近80%融合)时，取96孔板分为空白对照组(DMEM＋无细胞，比色时以此组调零，设12孔)、正常对照组、模型组、心脉通组；每组设6复孔。最后D-Hanks液冲洗，更换无血清的DMEM培养液，同时加入MTT液(20 μL/孔)，继续孵育4h后，弃去上清液，加入DMSO液(150 μL/孔)，室温下，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解。酶标仪检测各孔OD值(λ=570 nm)。

1.4 心肌细胞不同组蛋白激酶B（PKB/Akt）表达的免疫细胞化学技术 取造模成功的细胞，4%多聚甲醛固定，加一抗4℃过夜，30%的H2O2灭活内源性酶，滴加相应二抗。加入SABC复合物，DAB显色后，酒精梯度脱水，中性树胶封片。镜下观察，拍照并进行图象分析。

1.5 心肌细胞总RNA的提取及相应指标的RT-PCR 按说明书所给步骤，提取RNA，并对所提RNA进行纯度鉴定(OD260/OD280在1.8～2.0之间并进行RNA电泳)。按试剂盒的说明进行逆转录反应。第二步将逆转录好的cDNA进行PCR扩增实验，在NCBI(美国国立生物技术信息中心)中查询出Akt-1(gi：15100163)和内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)(gi：46409655)的mRNA全序，用引物设计软件PRIMER-5设计引物，并在NCBI中BLAST，比对同源性，确保唯一性。Akt-1的上游为5'AGGCATCCCTTCCTTACAG-3'，下游为5’-ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3’；目的基因大小为271bp。eNOS上游为5’-CACGAGGACATTTTCGGACT-3’，下游为5’-ACCTAATGAAGCGACGCAGT-3’，目的基因大小为201 bp。同时设计内参的引物序列上游为 5’-AGCTATT CTAGCCTTAGACTGAT-3’，下游为5’-CTAGCTTAGGTCA TTAGCTACTAG-3’，目的基因产物大小为385 bp。扩增条件同上。依说明书步骤进行DNA扩增，并将PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，拍照并用BIORAD对凝胶图象进行灰度测定，用目的基因的灰度和内参的灰度比来表示转录水平的相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS13.0采用不同样本均数的方差分析，数据以(±s)表示。

2 实验结果

2.1 心肌细胞原代培养鉴定 见图1。阳性信号呈棕黄色细密颗粒，位于胞浆。心肌细胞呈阳性反应，而非心肌细胞无阳性表达颗粒。结果显示心肌细胞分离、纯化效果良好，基本无其它细胞污染。

图1 心肌细胞原代培养免疫化学图 (400×)

2.2 各组形态学改变 见图2。常规倒置显微镜下观察细胞形态。正常对照组培养24 h形成同心圆放射状细胞簇，簇间借伪足相互连接形成功能合胞体搏动，每分钟60～150次，细胞可长成单层，长梭形或多角形，胞浆致密，核小，常为1个，偶可见双核，核周胞浆见粗颗粒，至72 h搏动频率、节律、强度趋于同步，细胞透光度好，搏动规则、有力，细胞边界由于长成一片而欠清楚。H2O2作用6 h后，可见心肌细胞发生显著的形态学改变，多数细胞回缩变圆，胞浆浓缩、胞膜起泡，胞体变小，细胞间桥结构减少，胞间隙明显增加。细胞边界清楚，透光度下降，搏动变慢且无力。也可见部分心肌细胞脱离、悬浮，溶解坏死。H2O2作用10 h后，细胞损伤更严重，多数细胞变小，固缩，死亡。镜下观察细胞间联系消失，细胞变为不透光的黑色点状物。心脉通组可见少量的心肌细胞伪足回缩，细胞脱落悬浮现象，但损伤程度较轻。

图2 各组形态学改变 (400×)

2.3 各组心肌细胞活力比较 见表1。各组心肌细胞在H2O2作用下活力下降，与正常对照组比较，模型组细胞活力显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明H2O2损伤模型建立成功；心脉通组细胞活力高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组心肌细胞活力比较(±s)

表1 各组心肌细胞活力比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组别正常对照组模型组心脉通组样本数666心肌细胞活力0.409±0.090 0.223±0.054①0.298±0.041①②

2.4 各组PKB表达比较 见图3、表2。正常对照组中只有少数细胞胞浆中有棕黄色表达。而模型组棕黄色颗粒较正常对照组增多，心脉通组较模型组显著增多。

图3 各组PKB表达变化 (400×)

表2 各组PKB表达比较(±s)

表2 各组PKB表达比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组别正常对照组模型组心脉通组样本数666 PK B表达83.28±0.573 106.88±2.741①167.98±5.749①②

2.5 各组PKB和eNOS转录水平变化比较 见图4、图5、表3。在正常状态下PKB的转录水平较低，模型组有所升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。且心脉通组的转录水平更高，与正常对照组和模型组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。正常情况下eNOS有表达，且表达水平是最高的。模型组中表达降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。心脉通组转录水平较模型组水平增高(P＜0.05)。

3 讨论

氧自由基在缺血心肌凋亡过程中起重要作用，本实验也进一步证实了氧化应激和缺血性心脏病有密切关系。PKB (protein kinase B)又称Akt，处于多条信号通路的重要交叉点，PKB的磷酸化在缺血所导致的细胞损伤方面有重要作用，如雌激素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用部分是通过磷酸化PKB而起到的[2]。PKB的作用底物有很多，其中eNOS可催化L-精氨酸与分子氧反应而产生NO。NO有调节血管张力，抑制白细胞黏附，抑制血小板聚集，抑制平滑肌细胞分裂增殖等生理功能[3]。eNOS和NO系统对心肌缺血的保护作用可能是通过抑制细胞凋亡，刺激新生血管生成，及抑制TGF-β1/ Smad-2信号传导途径来实现的[4]。

图4各组PKB电泳图

图5 eNOS电泳图

表3 各组PKB和eNOS转录水平变化比较(±s)

表3 各组PKB和eNOS转录水平变化比较(±s)

与正常对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组别正常对照组模型组心脉通组样本数666 PK B 0.40±0.022 0.60±0.026①0.88±0.027①②eN O S 1.01±0.052 0.63±0.032①0.92±0.154①②

H2O2可启动PKB通路，PKB的直接下游底物eNOS必定出现相应变化，心脉通含药血清可以提高PKB和eNOS在氧化损伤细胞中的表达；进而增加NO的产生，PKB的活化和eNOS的增加可以抑制心肌细胞的调亡，对氧化损伤状态下的心肌细胞产生保护作用，推测中药复方心脉通颗粒的作用是通过PKB/AKT-eNOS-NO途径，这也可能是其主要途径。

中医学所认识的胸痹心痛包括急慢性缺血性心脏病。胸痹心痛又多与血瘀有关。本实验以气血理论为基础，H2O2损伤很好模拟了缺血性心肌病，外界环境(H2O2)的损伤产生了细胞功能的损害，即产生了阳的不足，细胞跳动频率的下降也说明了阳或气的虚损，也即《伤寒论》所谓“阳微”。心脉通颗粒以人参、黄芪、丹参为主，组方以气药配以活血化瘀药，可以改善心脏的缺氧状态，减轻缺血对心脏的损伤。单味中药抗氧化作用研究很多，复方药较少。心脉通颗粒中药复方主要组成成分是总黄酮类物质，这为黄酮类成分的中药在对抗氧化损伤方面提供了一定证据，也为以后临床组方治疗心血管系统疾病方面提供了一定依据。但其详细完整的作用机制还有待于进一步研究证实。

[1]Kemp TJ，Causton HC，Clerk A．Changes in gene expression induced by H2O2in cardiac myocytes[J]．Biochem Biophys Res Commun，2003，307(2)：416-421.

[2]Arturo Rodriguez-Hernandez，Ivan Rubio-Gayosso，Israel Ramirez， et al．Intraluminal-restricted 17βestradiol exerts the same myocardial prote-ction against ischemia/reperfusion injury in vivo as free 17β-estradiol[J]．Steroids，2008，73(1)：528-538．

[3]汤健，周爱儒．心血管分子生物学[M]．北京：北京医科大学出版社，1999：108-114．

[4]Lei-Lei Chen， Hang Yin，Jun Huang．Inhibition of TGF-β1 signaling by eNOS gene transfer improves ventricular remodeling after myocardialinfarction through angiogenesis and reduction of apoptosis[J]．Cardiovascular Pathology，2007，16(4)：221-230．

（责任编辑：骆欢欢）

R542.2

A

0256-7415（2015）05-0267-04

10.13457/j.cnki.jncm.2015.05.127

2014-11-10

教育部留学回国人员基金资助项目（2003-406）

刘军明（1980-），男，主治中医师，研究方向：中西医结合防治心血管疾病。

敖杰男，E-mail：taojn@jnu.edu.cn。