马贤德，张威，关洪全

（辽宁中医药大学1.教学实验中心生物技术实验室；2.附属医院神经内科；3.基础医学院免疫病原生物教研室，沈阳 110847）

白色念珠菌感染对脾虚模型小鼠T细胞亚群的影响

马贤德1，张威2，关洪全3

（辽宁中医药大学1.教学实验中心生物技术实验室；2.附属医院神经内科；3.基础医学院免疫病原生物教研室，沈阳 110847）

目的探讨白色念珠菌感染后脾虚小鼠T细胞亚群的变化及其免疫机制。方法将健康SPF级昆明种小白鼠150只随机分为空白对照组（N1组，n=30）、空白感染白念组（N2组，n=40）、脾虚模型对照组（M1组，n=40）、脾虚感染白念组（M2组，n=40）。N2和M2组小鼠经口感染白色念珠菌（2×108CFU/mL，0.2 mL/10 g体质量）。分别于染菌第7、14、21天，从各组小鼠中随机抽取10只，检测小鼠肠黏膜固有层中CD4+/CD8+T细胞百分比、小肠组织中干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）mRNA及蛋白的表达水平。结果与N1组比较，N2组、M1组及M2组小鼠小肠黏膜固有层中CD4+T细胞比例下降（P＜0.01），CD8+T细胞比例上升（P＜0.01），CD4/CD8比值显著下降（P＜0.01），IFN-γ、IL-4mRNA及蛋白的表达水平上调（P＜0.01）。IFN-γ以M2组上调最为明显，而IL-4则以N2组上调最为明显。结论脾虚小鼠对白色念珠菌的易感性增加，感染的发生机制可能与机体自身对Th1/Th2平衡的调节密切相关。

脾虚证；白色念珠菌；感染；T细胞亚群

假丝酵母菌中，白假丝酵母菌（Candida albicans）是最常见的致病菌。白假丝酵母菌又称白色念珠菌，为条件性致病真菌。脾虚证是指脾气不足、失其健运所表现的一系列症候［1，2］，其现代医学的病理机制可归纳为消化系统机能减退、胃肠道黏膜保护性屏障作用减退、胃肠道激素水平紊乱、细胞内能量代谢减退、免疫功能低下等。研究表明，机体处于脾虚的状态下，对于白色念珠菌的易感性大大增加。本研究拟从T细胞亚群及Th1/Th2平衡角度探讨白色念珠菌感染脾虚模型小鼠的部分机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级昆明种小鼠150只，购自辽宁长生生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（辽）2010-0001。饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物室内［许可证号：SYXK（辽）2013-0009］。常规颗粒饲料喂养，自由食水，12 h昼夜节律。

1.1.2 菌株及试剂：白色念珠菌菌株（Candida albicans 03382株），由北京大学第一医院皮肤科惠赠。CD4、CD8流式抗体购自Biolegend公司［货号：CD4（100412），CD8（100706）］。干扰素γ抗体（anti-interferon gamma，anti-IFN-γ）及白细胞介素4抗体（antiinterleukin-4，anti-IL-4）抗体购自Abcam公司［货号：anti-IFN-γ（ab24979）；anti-IL-4（ab11524）］；HRP标记的二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.1.3 仪器设备：电热恒温培养箱（HH·B11·500型，上海跃进医疗器械厂）；凝胶成像分析系统（上海天能科技有限公司，Tanon-4200SF型）；垂直板电泳装置（上海天能科技有限公司，VE-180型）；梯度PCR仪（美国ABI公司，VERITI96孔梯度PCR型），水平电泳装置（上海天能科技有限公司，HE-120型）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组：将150只小鼠随机分为空白组（N组，n=70）和脾虚模型组（M组，n=80）。对M组小鼠采用饮食不节加劳倦过度的方法复制脾虚小鼠模型。模型复制成功后，再次分别将N组及M组小鼠各随机分为2组：空白对照组（N1组，n=30），空白感染白念组（N2组，n=40）；脾虚模型对照组（M1组，n=40），脾虚感染白念组（M2组，n=40）。

1.2.2 脾虚模型复制：实验第1天起，参照文献［3～5］，M组小鼠单日喂饲甘蓝，并强制性游泳至耐力极限；双日施加猪油脂灌胃（0.2 mL/10 g体质量），正常进食，连续14 d，N组小鼠正常饲养。实验14 d后，按照脾虚模型宏观诊断标准［6］对M组小鼠进行模型评价：造模小鼠出现体质量下降，便溏或稀便，食少纳呆，毛色枯槁，蜷缩聚堆、反应迟钝甚至胆怯状态等表现，说明脾虚造模成功。

1.2.3 白色念珠菌感染：脾虚模型复制成功后，对N组和M组小鼠再次进行分组，次日对N2组和M2组小鼠经口感染白色念珠菌（浓度2×108CFU/mL，剂量0.2 mL/10 g体质量），N1、M1组小鼠给予等量生理盐水经口灌胃。

1.2.4 指标检测：分别于染菌第7、14、21天，从各组小鼠中随机抽取10只，进行相关指标检测。采用流式细胞术检测各组小鼠肠黏膜固有层中CD4+/CD8+T细胞百分比。采用RT-PCR法检测各组小鼠小肠组织中IFN-γ、IL-4mRNA的表达水平。引物序列：IFN-γ：上游5′-CACTCGACCTTAATCTA-3′，下游5′-CTCTTGATTCAATGCTTCA-3′，扩增片段长度514 bp；IL-4：上游5′-ATGGGTCTCACCTCCCAACT G-3′，下游5′-TCAATGCCTGTAGTATTTCTTC-3′，扩增片段长度399 bp；β-actin：5′-AGCGGGAAATCG TGCGTG-3′，5′-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3′，扩增片段长度288 bp。扩增后行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统采集图像，测定条带积分光密度值，并进行统计分析。采用Western blot法检测各组小鼠小肠组织中IFN-γ、IL-4蛋白的表达水平，提取小肠组织中总蛋白，电泳后转印至PVDF膜，经一抗（1∶1 500）、二抗（1∶2 000）4℃孵育过夜后，ECL发光，凝胶成像分析系统采集图像，测定条带灰度值，并进行统计分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学软件进行统计分析。计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠T细胞亚群检测结果

感染白色念珠菌后第7、14、21天，与N1组比较，N2组、M1组及M2组小鼠小肠黏膜固有层中CD4+T细胞比例均下降，但染菌后第7天N2菌组差异无统计学意义；CD8+T细胞比例均不同程度上升，除染菌第14天外，其余2时间点仅M2组与N1组比较有统计学差异（P＜0.01）；CD4+/CD8+比值不同程度下降，与N1组比较，M1组和M2组有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

2.2 各组小鼠小肠组织中IFN-γ、IL-4 mRNA及蛋白的表达水平

RT-PCR和Western blot结果显示：与N1组比较，其他3组小鼠小肠组织中IFN-γmRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与N2组比较，M1组IFN-γ mRNA及蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），而M2组则显著升高（P＜0.05）；与M1组比较，M2组IFN-γmRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。见表2，图1。

表1 实验第7、14、21天各组小鼠小肠黏膜固有层中T细胞亚群检测结果Tab.1 Analysis of T cell subsets in the lamina of the natural layer of the small intestine on day 7，14 and 21

表1 实验第7、14、21天各组小鼠小肠黏膜固有层中T细胞亚群检测结果Tab.1 Analysis of T cell subsets in the lamina of the natural layer of the small intestine on day 7，14 and 21

1）P＜0.05，2）P＜0.01 vs N1 group；3）P＜0.01 vs N2 group；4）P＜0.05，5）P＜0.01 vs M1 group.

Group CD4+T（%） CD8+T（%） CD4+/CD8+ N1 Day 7 37.23±1.11 23.18±3.32 1.63±0.23 Day 14 38.24±1.31 21.43±3.15 1.82±0.29 Day 21 38.51±1.41 23.58±2.24 1.65±0.15 N2 Day 7 36.56±1.67 24.02±3.40 1.56±0.28 Day 14 32.65±1.402） 27.27±4.192） 1.23±0.222）Day 21 34.96±2.322） 27.10±3.39 1.32±0.252）M1 Day 7 33.96±2.162），3） 25.40±3.55 1.37±0.281）Day 14 32.54±1.442） 27.23±3.642） 1.22±0.212）Day 21 34.98±1.792） 25.63±2.97 1.38±0.212）M2 Day 7 31.10±1.722），3），4） 30.41±2.672），3），4） 1.03±0.122），3），4）Day 14 27.78±0.902），3），4） 31.90±3.302），3），4） 0.88±0.112），3），4）Day 21 30.30±1.622），3），4） 29.87±2.852），4），5） 1.02±0.132），3），4）

图1 感染不同时间各组小鼠小肠组织中IFN-γmRNA和蛋白的表达Fig.1 The expression of IFN-γmRNA and protein in the small intestine at day 7，14，21

与N1组比较，其他3组小鼠小肠组织中IL-4 mRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与N2组比较，M1组及M2组IL-4mRNA及蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；与M1组比较，M2组IL-4 mRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.01，P＜0.05）。见表2，图2。

3 讨论

中医学脾的范畴不同于现代医学，因此，脾虚并不是解剖学中脾脏的某种病理改变。根据中医学关于脾虚的描述可知，脾虚证指的是消化系统出现的一系列症候群，主要临床表现为消化不良、小肠吸收功能减退、机体免疫力低下等［7，8］。临床观察发现，脾虚证更容易出现在消耗性疾病的中晚期。

白色念珠菌属于条件性致病菌的一种，正常情况下寄生在人体多个部位，不致病。当机体处于免疫功能紊乱或菌群失调状态时，极易引发急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌感染疾病。白色念珠菌易侵犯皮肤、黏膜，也可引发内脏或全身的系统性感染［9］。当机体处于脾虚状态时，机体的免疫功能低下，皮肤黏膜的正常菌群平衡遭到破坏，属于白色念珠菌感染高发期。研究表明，脾虚状态下发生白色念珠菌感染，可导致体内细胞因子表达水平的改变，同时局部黏膜免疫也受到一定的抑制［10，11］。

本研究结果显示：小鼠感染白色念珠菌后，小肠黏膜固有层中CD4+T细胞百分比显著下降，而脾虚状态小鼠的CD4+T细胞百分比也比N1组显著降低，M2组小鼠CD4+T细胞最少；CD8+T细胞百分比则与CD4+T相反，与N1组比较，N2组、M1组、M2组呈逐渐增多趋势，从而导致CD4+T/CD8+T的比例呈逐渐降低的趋势。提示白色念珠菌感染对正常机体的免疫功能具有一定的抑制作用，且当机体处于脾虚状态时，免疫功能下降更为明显，这可能是脾虚状态对白色念珠菌易感的原因之一。表明脾虚状态与白色念珠菌感染可对免疫功能的抑制产生协同作用。本研究结果还发现，感染最严重阶段发生在染菌后的第2周，第3周各项指标呈现好转趋势，分析其原因可能是一次染菌时机体具有抗感染能力，该剂量白色念珠菌引发的感染具有自愈的可能，且染菌后立即停止了脾虚模型复制的诱导因素，模型在去除诱导因素后具有一定的自愈性。

表2 实验第7、14、21天各组小鼠小肠组织中IFN-γ、IL-4mRNA及蛋白表达水平Tab.2 The expression of IFN-γ and IL-4mRNA and protein in the small intestine on day 7，14 and 21

表2 实验第7、14、21天各组小鼠小肠组织中IFN-γ、IL-4mRNA及蛋白表达水平Tab.2 The expression of IFN-γ and IL-4mRNA and protein in the small intestine on day 7，14 and 21

1）P＜0.01 vs N1 group；2）P＜0.05，3）P＜0.01 vs N2 group；4）P＜0.05，5）P＜0.01 vs M1 group.

Group IFN-γ IL-4 mRNA Protein mRNA Protein N1 Day 7 0.231±0.022 0.235±0.018 0.254±0.027 0.274±0.029 Day 14 0.241±0.020 0.234±0.021 0.246±0.013 0.267±0.024 Day 21 0.224±0.021 0.221±0.011 0.261±0.029 0.258±0.025 N2 Day 7 0.438±0.0511） 0.425±0.0481） 0.623±0.0691） 0.629±0.0661）Day 14 0.400±0.0411） 0.414±0.0451） 0.663±0.0571） 0.685±0.0461）Day 21 0.383±0.0261） 0.390±0.0361） 0.729±0.0711） 0.709±0.0761）M1 Day 7 0.365±0.0311），3） 0.375±0.0371），2） 0.390±0.0331），3） 0.398±0.0351），3）Day 14 0.349±0.0391），3） 0.354±0.0301），3） 0.419±0.0361），3） 0.432±0.0391），3）Day 21 0.340±0.0221），3） 0.337±0.0261），3） 0.439±0.0271），3） 0.437±0.0391），3）M2 Day 7 0.562±0.0541），3），4） 0.520±0.0561），3），5） 0.442±0.0461），3），4） 0.453±0.0291），3），4）Day 14 0.501±0.0491），3），4） 0.508±0.0611），3），5） 0.470±0.0471），3），5） 0.477±0.0461），3），4）Day 21 0.481±0.0531），3），4） 0.475±0.0511），3），4） 0.521±0.0551），3），5） 0.506±0.0421），3），5）

图2 感染不同时间各组小鼠小肠组织中IL-4mRNA和蛋白的表达Fig.2 The expression of IL-4mRNA and protein in the small intestine at day 7，14，21

根据所分泌细胞因子的种类和功能，CD4+T细胞分为Th1和Th2细胞。Th1细胞分泌的主要细胞因子为IFN-γ、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、肿瘤坏死因子β（tumor necrosis factor β，TNF-β）等；Th2细胞分泌的主要细胞因子为IL-4、IL-10等。研究表明，IFN-γ具有促进Th0细胞分化为Th1，同时抑制Th2细胞的增殖的作用，而IL-4具有诱导Th2细胞分化的作用，二者相互抑制并获得平衡。病理情况下，Th1/Th2细胞的平衡发生偏移，引起Th1/Th2细胞所分泌细胞因子的量发生改变，从而引发疾病。

本研究结果显示：与N1组比较，N2组、M1组、M2组小鼠小肠组织中IFN-γ、IL-4 mRNA及蛋白的表达水平均上调，IFN-γ以M2组上调最为明显，而IL-4则以N2组上调最为明显。提示白色念珠菌感染后机体的免疫功能状态决定了感染的发生、发展，当机体免疫功能正常时，染菌后以Th2细胞辅助的体液免疫应答为主导，而当机体免疫功能低下时，染菌后则以Th1细胞参与的细胞免疫为主导。

综上所述，脾虚小鼠对白色念珠菌的易感性增加，感染的发生机制可能与机体自身对Th1/Th2平衡的调节密切相关。

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（编辑 王又冬）

Influence of Candida albicans Infection on T Cell Subsets in the Mice with Spleen Deficiency

MAXian-de1，ZHANG Wei2，GUAN Hong-quan3

（1.Biology Technology Lab，Teaching Experiment Center，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Department of Internal Medicine-neurology，Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；3.Department of Immunology and Pathogenic Biology，Basic Medical College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

ObjectiveTo observe the influence of Candida albicans infection on T cell subsets in mice with spleen deficiency，so as to explore the immune mechanism.MethodsTotally 150 healthy SPF mice were randomly divided into four groups：control group（N1 group，n=30）；Candida albicans infection group（N2，n=40），spleen deficiency model group（M1，n=40），spleen deficiency model combined with Candida albicans infection group（M2，n=40）.N2 and M1 mice were infected by Candida albicans at a concentration of 2×108CFU/mL.Ten mice were randomly selected from each group at 7，14，and 21 days after infection respectively，and the index was detected.Flow cytometry was used to detect the percentage of CD4+/CD8+T cells in intestinal mucosa of mice，and the expression level of IL-4and IFN-γmRNA was detected by RT-PCR assay.The levels of IFN-γ and IL-4 were detected by Western blot assay.ResultsCompared with N1 group，the proportion of CD4+T cells in the lamina of the natural layer of the small intestine was decreased（P＜0.01），the proportion of CD8+T cells was increased（P＜0.01），the ratio of the two was significantly decreased（P＜0.01），and the expression levels of IL-4，mRNA I FN-γ and protein in the small intestine tissues were increased in other groups（P＜0.01）.In addition，the expression level of IFN-γ was significantly increased in M2 group，while the expression of IL-4 was significantly increased in N2 group.ConclusionThe susceptibility of Candida albicans infection was increased in spleen deficiency mice，which may be closely related to the regulation of Th1/Th2 balance.

spleen deficiency；Candida albicans；infection；T lymphocyte subsets

R392.9

A

0258-4646（2015）12-1070-05

国家自然科学基金（81173145）

马贤德（1979-），男，实验师，博士研究生.

关洪全，E-mail：hongquanguan@sina.com

2015-10-27

网络出版时间：