朱　江(综述)，马　洁(审校)

(天津市康婷生物工程有限公司生物医学研究院，天津 300385)



脂肪干细胞联合富血小板血浆修复关节软骨研究进展

朱江※(综述)，马洁(审校)

(天津市康婷生物工程有限公司生物医学研究院，天津 300385)

摘要：关节软骨容易受到损伤，而且缺乏自我修复的能力，传统治疗方法效果并不理想。随着再生医学和组织工程学的发展，越来越多的研究表明，自体脂肪干细胞联合富血小板血浆(PRP)修复关节软骨疗效显著。干细胞是尚未分化的原始细胞，在一定条件下可以向骨、软骨和脂肪等细胞分化；PRP是高度浓缩的血小板提取物，含有多种细胞生长因子。将干细胞与PRP联合应用，双重强化了关节软骨的修复作用，且来源自体，安全可靠。

关键词：脂肪干细胞；间充质干细胞；富血小板血浆；关节软骨；生长因子

关节软骨是一种高度分化的组织，一旦受到损伤，其自身修复能力非常有限，因为它无神经支配，亦无血管分布，祖细胞无法到达患处，而且周围的软骨细胞也不能迁移至患处产生修复基质。轻微的软骨损伤能够发展成为大范围的骨性关节炎，治疗难度很大，特别是年轻患者，不宜做关节置换。临床上用于治疗关节软骨损伤的外科手术主要分为两类：一类侧重于缓解症状，例如软骨下钻孔等；另一类侧重于彻底修复，如自体/异体软骨移植等。随着再生医学和组织工程学的发展，研究者尝试利用干细胞作为种子细胞，再配合富血小板血浆(plated-rich plasma,PRP)中丰富的细胞因子，修复关节软骨损伤，临床效果显著。现就脂肪干细胞联合PRP修复关节软骨的研究进展予以综述。

1多向分化潜能的脂肪干细胞

1.1干细胞的概念干细胞是一类未分化的，能够自我复制更新的，具有多向分化潜能的原始细胞，根据其来源的不同，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。理论上，胚胎干细胞来自于受精卵，具有全能性，可以分化为三胚层的任何一种组织，然而在实际研究应用中受到了宗教、政治和伦理等诸多因素的限制。成体干细胞在个体出生后，仍然保持未分化及稳定状态，被激活后可以向多种方向的细胞组织增生和分化，因此又被称之为多能干细胞。在身体的很多组织中含有大量的成体干细胞，脂肪和骨髓是其主要的来源。

与骨髓一样，脂肪组织起源于中胚层，含有大量的微血管网络，包括胞外基质和血管周围间质等，在再生医学领域有非常广阔的应用前景。理想的干细胞种子应该满足以下条件：①含量丰富；②获取方法尽可能对身体造成较小的创伤；③能够通过常规的且可重复的途径向多方向分化；④能安全、有效的移植[1]。

1.2脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,AD-SCs)的优势早在20世纪90年代，研究者发现一些与肌肉骨骼组织相关的祖细胞参与了结缔组织的修复，由于它们可以向间质组织分化，而且是组织修复过程中非常重要的元素，1991年Caplan[2]首次将其定义为“间充质干细胞”(mesenchymal stem cells,MSCs)。

传统观点认为骨髓富含MSCs，后来研究发现，脂肪组织也含有相当数量的MSCs，而且同样具有纤维样形态、集落形成能力、特异免疫表型(CD44+，CD73+，CD90+，CD105+，CD14-，CD34-，CD45-)、易分离和多向分化等特点[3-6]。严格意义上来说，脂肪组织中除了含有大量的MSCs以外，在细胞外基质中还含有脂肪前体细胞(祖细胞)、外膜细胞、内皮细胞等，它们在组织修复中都扮演了重要的角色，所以统称为AD-SCs，而不仅仅是脂肪MSCs(adipose-derived MSCs，AD-MSCs)。研究者认为，脂肪是一个复杂的组织，相比骨髓而言，不仅更容易获取，而且含有更多数量的未分化的MSCs，是骨髓的500～1000倍[7]。另外，脂肪是天然的活性生物支架，为干细胞生长、增殖和分化营造良好的微环境。

1.3AD-SCs的研究AD-SCs参与修复多种类型的细胞损伤，例如软骨损伤、骨关节炎血管再生、肌腱损伤、韧带损伤、椎间盘损伤、心肌缺血、移植物抗宿主病以及成骨不全症等。研究者在犬[8]、兔[9]、马[10]、鼠[11]等动物身上做了大量的实验研究，同时也做了大量的Ⅰ期、Ⅱ期临床试验，结果表明，AD-SCs极大地改善了关节软骨功能，而且无不良反应[12]。

2富含生长因子的PRP

2.1PRP的概念PRP是指血小板浓度超过正常生理浓度数倍的血浆浓缩物，一般认为其浓度应至少高于生理全血浓度4倍才能达到有效治疗浓度[13]。正常外周血仅含有6%的血小板，即每毫升含有大约2500个。而在高浓度PRP中，其浓度可高达94%，即每毫升含有大约10 000个血小板。根据含有白细胞的多少又可以将PRP分为贫白细胞PRP和富白细胞PRP。后者有更好的抗炎作用，因为白细胞释放出的递质会诱导包括炎性细胞在内的多种细胞聚集和黏附，利于组织修复。所以该文研究的是富白细胞PRP。根据应用形式，又可将PRP分为未激活PRP和激活PRP，后者通常具有凝胶和提取物等形态。血小板被激活释放生长因子的同时，释放出的纤维蛋白原聚合为纤维蛋白，连接成网状，形成肉眼可见的凝胶状，有一定的黏附性和强度，可以作为种子细胞生长依附的支架，在组织工程学中有广泛应用。而PRP提取物是指血小板活化后释放入血浆或血清中含有的生长因子和活性蛋白的上清液，可以作为种子细胞的溶剂或者培养细胞的营养物。

2.2PRP作用机制早在20世纪90年代，PRP应用于外科手术中，加速伤口愈合。当时设备庞大，造价昂贵，且只能在医院手术室中开展。最近10年，设备越来越小，成本越来越低，在普通的洁净房间内就能实施治疗，所以PRP的临床应用越来越广泛。

长期以来，人们认为血小板在凝血止血方面发挥着重要的作用。而实际上，这只是其中一个功能。血小板中含有大量的重要的信号蛋白、生长因子、化学因子、细胞因子和其他生物活性因子，例如血小板衍生生长因子、转化生长因子β、类胰岛素生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、上皮细胞生长因子等[14]，它们能够启动和调节一系列炎症级联反应，最终起到修复组织和愈合伤口的作用[15]。而且，一定浓度的血小板还可以激活间质细胞等修复细胞，使其增殖、分化和迁移至损伤部位。

2.3PRP制备方法美国食品药品管理局认证并商业化生产的PRP制备系统有9种[16]，其中部分制备系统能快速、稳定地获得PRP。但在国内，这样的装置并不多，多采用开放式二次离心法制备。基本原理是将采集的外周血通过离心，分为3层，上层为上清液，下层为红细胞，中间浅黄色层即为PRP。

从2010年起，世界反兴奋剂组织禁止肌肉应用PRP，同时要求其他的应用方法也必须符合治疗应用的国际标准。所以，局部注射PRP是否对整体产生影响[17]，临床应用PRP有无不良反应，还有待进一步研究。

3AD-SCs联合PRP修复关节软骨

该方法起源于20世纪30年代，当时采用葡萄糖来治疗肌肉骨骼损伤，效果良好。到21世纪初，研究者开始尝试应用PRP或者干细胞来治疗，取得了一定的成果。后来，将干细胞特别是AD-SCs和PRP联合应用，效果显著。2013年，Koh等[18]对18例膝关节损伤的患者进行了临床试验，观察AD-SCs联合PRP的治疗效果，结果显示该方法缓解了疼痛，提高了膝关节功能。

3.1理想的种子细胞库AD-SCs为结缔组织和关节修复提供了种子细胞库。研究表明[19]，AD-SCs能够激活成纤维细胞，使其增殖、迁移以及分泌胶原蛋白等，增强结缔组织的韧性强度，促进其愈合。如前所述，AD-SCs有分化为软骨、肌腱、韧带、骨骼和肌肉等组织的能力，并且能够分泌多种生长因子，影响和控制着损伤区域周围的细胞[20]。所以，当传统的葡萄糖疗法或者PRP疗法治疗不甚理想时，尝试干细胞疗法是不错的选择。

3.2良好的营养环境高浓度PRP为组织修复营造了良好的营养环境。高浓度PRP含有大量的生长因子，能够激活肌肉骨骼自我修复能力，这对于骨组织修复至关重要，特别是肌腱的早期修复[21]。而且，AD-SCs的增殖和分化与PRP的浓度息息相关。高浓度PRP能够释放大量的血小板衍生生长因子、转化生长因子β1和其他生长因子，能够显著提高干细胞增殖和血管再生能力。

3.3立体微环境脂肪为干细胞生存和发挥作用提供了立体的微环境，细胞与细胞之间一系列复杂的物理、化学信号的传递影响着干细胞的功能和状态[22]，因此未分化的间质细胞一定要依附于其他细胞才能够有效的增殖和分化。2010年，Little等[23]将AD-MSCs植入一个模拟的由韧带成分和胶原凝胶构成的韧带基质中，成功地证明了细胞向韧带组织分化，而且基因和表型表达与韧带一致。Albano和Alexander[24]报道,将富含MSCs和活性生物支架的自体脂肪组织成功修复了髌骨肌腱撕裂。

3.4获取AD-SCs吸脂的部位大多在腹部或者侧腹，吸脂的方法有多种[25]。2013年，Van Pham等[26]利用无菌注射器抽吸40～80 mL脂肪组织，通过试剂盒(AD-SCs Extraction kit,GeneWorld,Vietnam)提取分离出基质血管层细胞，经过离心、洗涤和消化等步骤，接种于培养瓶中培养扩增。2011年，Alderman 等[27]利用TulipTM装置获得5～20 mL脂肪组织，经简单处理但无需培养扩增。是否需要培养扩增，取决于研究者的理论、治疗所需要的细胞数量以及当地的政策法规等。

3.5注射方法不同的临床医师依据多年的经验和理论会有不同的注射方法。Alderman等[27]在超声的引导和定位下，利多卡因局部麻醉，通过螺口注射器和穿刺针将AD-SCs和PRP混合物注射到损伤部位，组织释放出凝血酶和其他调节因子激活PRP，并且吸引生长因子和AD-SCs向损伤部位聚集。利多卡因对于干细胞的活性是否有影响一直存在争议，有待进一步研究。

经国内外研究者多次临床试验证明，自体AD-SCs联合PRP修复关节软骨是安全而有效的。评价该方法应从以下3点考虑：①方法安全、有效；②简单易行，在门诊区内就可以完成；③符合当地的政策法规。尽管有很多文献报道了干细胞疗法的诸多优点，但是临床界内并没有形成统一的、标准的操作方法和指南，因此在治疗方法、治疗效果和评价标准等方面存在很大差异。

另外，在干细胞来源方面，不同的研究者也有各自不同的见解。MSCs主要存在于骨髓、脂肪以及脐带等组织中。Centeno等[28]利用骨髓MSCs治疗膝关节炎效果显著。考虑到抽取骨髓的过程使患者感到痛苦，脐带又来源于异体存在安全风险，所以脂肪干细胞受到更多研究者的青睐，不仅获取方法简单，而且其数量也是骨髓的近千倍。但也有研究指出，AD-SCs大量表达和分泌血管内皮生长因子α，阻止软骨细胞再生[29]。

4结语

关节软骨修复一直是临床上尚未解决的难题，传统治疗方法效果并不理想。脂肪干细胞和PRP的联合应用为临床医学界提供了一个新的思路和有效的治疗方法。具有多向分化潜能的种子细胞，在多种生长因子的滋养下，在立体的微环境中，增殖分化，修复损伤的结缔组织。其疗效还有待更多的临床病例观察和确认，其方法和标准还需要更多的研究者统一和制订。但是有理由相信，再生医学发展具有广阔的应用前景。

参考文献

[1]Gimble JM,Katz AJ,Bunnell B.Adipose-derived stem cells for regenerative medicine[J].Circ Res,2007,100(9):1249-1260.

[2]Caplan AI.Mesenchymal stem cells[J].J Orthop Res,1991,9(5):641-650.

[3]Zimmerlin L,Donnenberg VS,Rubin JP,etal.Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells[J].Cytometry A,2013,83(1):134-140.

[4]Zhu X,Du J,Liu G.The comparison of multilineage differentiation of bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells[J].Clin Lab,2012,58(9/10):897-903.

[5]Gaiba S,Franca LP,Franca JP,etal.Characterization of human adipose-derived stem cells[J].Acta Cir Bras，2012,27(7):471-476.

[6]Khan WS,Adesida AB,Tew SR,etal.Fat pad-derived mesenchymal stem cells as a potential source for cell-based adipose tissue repair strategies[J].Cell Prolif,2012,45(2):111-120.

[7]Fraser JK,Wulur I,Alfonso Z,etal.Fat tissue:an underappreciated source of stem cells for biotechnology[J].Trends Biotechnol,2006,24(4):150-154.

[8]Black LL,Gaynor J,Adams C,etal.Effect of intraarticular injection of autologous adipose-derived mesenchymal stem and regenerative cells on clinical signs of chronic osteoarthritis of the elbow joint in dogs[J].Vet Ther,2008,9(3):192-200.

[9]Toghraie FS,Chenari N,Gholipour MA,etal.Treatment of osteoarthritis with infrapatellar fat pad derived mesenchymal stem cells in rabbit[J].Knee,2011,18(2):71-75.

[10]Frisbie DD,Kisiday JD,Kawcak CE,etal.Evaluation of adipose-derived stromal vascular fraction or bone marrow-derived mesenchymal stem cells for treatment of osteoarthritis[J].J Orthop Res,2009,27(12):1675-1680.

[11]Lee JM,Im GI.SOX trio-co-transduced adipose stem cells in fibrin gel to enhance cartilage repair and delay the progression of osteoarthritis in the rat[J].Biomaterials,2012,33(7):2016-2024.

[12]Tobita M,Orbay H,Mizuno H.Adipose-derived stem cells:current findings and future perspectives[J].Discov Med,2011,11(57):160-170.

[13]Weibrich G,Hansen T,Kleis W,etal.Effect of platelet concentration in platelet-rich plasma on peri-implant bone regeneration[J].Bone,2004,34(4):665-671.

[14]Greaney L,Hamilton B.Growth factor delivery methods in the management of sports injuries:the state of play[J].Br J Sports Med,2008,42(5):314-320.

[15]Foster TE,Puskas BL,Mandelbaun BR,etal.Platelet-rich plasma:from basic science to clinical applications[J].Am J Sports Med,2009,37(11):2259-2272.

[16]李明,张长青,袁霆，等.富血小板血浆制备套装的评估研究[J].中国修复重建外科杂志,2011,25(11):112-116.

[17]Banfi G,Corsi MM,Volpi P.Could platelet rich plasma have effects on systemic circulating growth factors and cytokine release in orthopaedic applications?[J].Br J Sports Med,2006,40(10):816.

[18]Koh YG,Jo SB,Kwon OR,etal.Mesenchymal stem cell injections improve symptoms of knee osteoarthritis[J].Arthroscopy,2013,29(4):748-755.

[19]Uysai AC,Mizuno H.Differentiation of adipose-derived stem cells for tendon repair[J].Methods Mol Biol,2011,702:443-451.

[20]Kim WS,Park BS,Sung JH.The wound-healing and antioxidant effect of adipose-derived stem cells[J].Expert Opin Biol Ther,2009,9(7):879-887.

[21]Lyras DN,Kazakos K,Verettas D,etal.The influence of platelet-rich plasma on angiogenesis during the early phase of tendon healing[J].Foot Ankle Int,2009,30(11):1101-1106.

[22]Metallo CM,Mohr JC,Detzel CJ,etal.Engineering the stem cell microenvironment[J].Biotechnol Prog,2007,23(1):18-23.

[23]Little D,Guilak F,Ruch DS.Ligament-derived matrix stimulates a ligamentous phenotype in human adipose-derived stem cells[J].Tissue Eng Part A,2010,16(7):2307-2319.

[24]Albano JJ,Alexander RW.Autologous fat grafting as mesenchymal stem cell source and living bioscaffold in a patellar tendon tear[J].Clin J Sport Med,2011,21(4):359-361.

[25]付寅生,张怡.现代吸脂技术采集脂肪混合物在脂肪干细胞制备领域中的应用[J].中国组织工程研究,2014,18(1):131-136.

[26]Van Pham P,Bui KH,Ngo DQ,etal.Activated platelet-rich plasma improves adipose-derived stem cell transplantation efficiency in injured articular cartilage[J].Stem Cell Res Ther,2013,4(4):91.

[27]Alderman DD,Alexander RW,Harris GR,etal.Stem cell prolotherapy in regenerative medicine background,theory and protocols[J].J Prolotherapy,2011,3(3)：689-708.

[28]Centeno CJ,Busse D,Kisiday J,etal.Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted,autologous mesenchymal stem cells[J].Pain Physician,2008,11(3):343-353.

[29]Lee CS,Burnsed OA,Raghuram V,etal.Adipose stem cells can secrete angiogenic factors that inhibit hyaline cartilage regenera-tion[J].Stem Cell Res Ther,2012,3(4):35.

Adipose-derived Stem Cells Combined with Platelet-rich Plasma for Injured Articular CartilageZHUJiang,MAJie.(BiomedicalResearchInstitute,KangtingBiotechnologyCo.Ltd,Tianjin300385,China)

Abstract:Articular cartilage is vulnerable to damage,and lack of the ability of self-repair.Traditional treatments are not ideal.With the development of regenerative medicine and tissue engineering,more and more studies show that the method combining autologous adipose-derived stem cells with platelet-rich plasma(PRP) for injured articular cartilage has remarkable effect.Stem cells are primitively undifferentiated cells which can differentiate into the bone,cartilage and fat cells under certain conditions;PRP is a highly concentrated platelet extract containing a variety of cell growth factors.The joint application doubly strengthens the effect of articular cartilage repairing,and is safe and reliable because of the autologous resources.

Key words:Adipose-derived stem cells; Mesenchymal stem cells; Platelet-rich plasma; Articular cartilage; Growth factors

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-01-17编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.016

中图分类号：R684.3

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)14-2535-03