蒋旭平，沈百欣(综述)，张　炜(审校)

(1.南京医科大学第一附属医院泌尿外科，南京 210029； 2.南京医科大学第二附属医院泌尿外科，南京 210011)



分子生物医学

邻苯二甲酸酯类化合物在引起尿道下裂过程中对Leydig细胞的影响

蒋旭平1△，沈百欣2(综述)，张炜1※(审校)

(1.南京医科大学第一附属医院泌尿外科，南京 210029； 2.南京医科大学第二附属医院泌尿外科，南京 210011)

摘要：近年来，新生儿尿道下裂的发病率呈逐年上升的趋势，越来越受到专家和学者的重视。邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)被认为是新生儿尿道下裂的作用因素之一，其在环境中的广泛存在对人类的健康产生严重影响，尤其在雄性生殖系统方面。多项研究表明，Leydig细胞是PAEs的靶细胞之一，但PAEs对Leydig细胞的作用机制尚不明确。该文阐述PAEs对Leydig细胞影响的最新发现，并讨论PAEs在导致尿道下裂过程中，对Leydig细胞作用机制的最新进展，为后续的研究和探索提供新的思路。

关键词：邻苯二甲酸酯类化合物；尿道下裂；Leydig细胞

尿道下裂是男性儿童泌尿生殖系最常见的先天畸形之一，发病率为出生男婴的1/300～1/250[1]，并且在世界范围内呈逐渐增加的趋势[2-4]。邻苯二甲酸酯类化合物(phthalate acid esters，PAEs)是尿道下裂的重要发病因素之一，是一类脂溶性有机化合物，作为塑化剂被广泛应用[5]。PAEs包括邻苯二甲酸-2-乙基己基酯(di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)等几十种，广泛存在于空气、土壤和水源中，可通过呼吸道、皮肤、消化道以及输血、肾透析等途径进入人体，对雄性生殖系统产生显著影响。近几年，PAEs导致尿道下裂的机制被广泛的研究，Leydig细胞是PAEs的重要靶细胞，现就PAEs对Leydig细胞的影响及其作用机制予以综述。

1尿道下裂的形成及其影响因素

在胚胎发育期，尿道沟在腹侧从后向前闭合，形成正常男性尿道，如发育障碍、尿道沟未完全闭合，就形成尿道下裂。尿道下裂常合并发生隐睾、睾丸癌和精子发生异常，这些疾病被统称为睾丸发育不全综合征，是男性胎儿在胚胎和性腺发育时受到干扰，而形成生殖系统的一系列异常。尿道下裂的发病机制至今尚不明确，可能涉及遗传因素[6]、内分泌因素[7]、环境因素[8]和其他因素。目前研究多集中在具有拟雌激素或抗雄激素作用的内分泌干扰物质，PAEs是其中重要的一类，暴露于这些物质中是尿道下裂的一个重要发病因素[9]。

2PAEs对Leydig细胞的影响

Leydig细胞是睾丸特异性细胞，大多数哺乳动物在睾丸发育过程中会有两代不同的Leydig细胞，即胎儿型Leydig细胞(fetal leydig cell，FLCs)和成年型Leydig细胞(adult leydig cell，ALCs)，在人类胎儿期终末阶段和啮齿类动物出生后的第2周，FLCs逐渐被ALCs取代。在胚胎发育后期，睾酮与雄激素受体结合后诱导外生殖器、尿道和前列腺的形成，胚胎期Leydig细胞分泌睾酮能力的降低会对雄性生殖系统产生重大影响。FLCs是胚胎期睾酮的唯一来源，PAEs对Leydig细胞的影响在尿道下裂的发生过程中起很关键的作用。

2.1实验模型张炜等[10]运用DBP成功诱导建立了大鼠尿道下裂的动物模型。目前生理和内分泌领域的比较学研究认为，大鼠暴露于PAEs引发生殖系统出生缺陷的关键因素对人类研究具有很高的价值[11-13]，大量尿道下裂的研究都借助于大鼠模型。

2.2PAEs对Leydig细胞形态结构的影响PAEs最显著的影响是引起Leydig细胞聚集增生，该现象由Parks首次报道[14]。Leydig细胞异常地向睾丸中心位置迁移并聚集在一起，形成一个巨大的病灶，病灶由异常的曲细精管和管内的Leydig细胞组成，并将支持细胞包围在其中，增生的细胞可能来源于睾丸间质干细胞[15]。在亚细胞水平上，PAEs对Leydig细胞的影响也有很多发现。对孕12～21 d的SD大鼠用100 mg/(kg·d)的DBP进行处理，雄性仔鼠在7周龄大时，其Leydig细胞核大小、延伸率、周边染色质聚集参数出现增高，但网状染色质的分布和孤立染色质的聚集参数明显降低[16]；20周大时，雄性仔鼠的Leydig细胞出现不典型增生，此时光学设备下可观察到聚集的Leydig细胞出现卵圆状的细胞核，胞核内有核仁和大量嗜酸性物质，胞质内出现大量游离的核糖体、中间丝、条带状内质网等[17]；而内质网随着小鼠周龄的增长会有不同变化，5～7周龄时，内质网满布于Leydig细胞内，此后逐渐降低，至17周时消失[18]。在PAEs作用下，Leydig细胞如何产生这些复杂的形态变化及变化的意义都尚未被阐明，还有待进一步研究。

2.3PAEs对Leydig细胞分泌功能的影响Klinefelter等[19]的研究结果表明，PAEs使Leydig细胞聚集增生的同时，睾酮水平也会下降，说明增生并未增加Leydig细胞分泌睾酮的能力。其他研究者也证实，PAEs会降低Leydig细胞的活性，并影响睾酮生成[17-18,20-21]。Li等[22]利用乙烷二甲烷磺酸盐消除成年大鼠睾丸Leydig细胞，在新生Leydig细胞形成的过程中用PAEs对大鼠进行处理，发现PAES暴露后相对于对照组Leydig细胞数量明显增多，而睾酮水平降低，Leydig细胞特异性标志物胆固醇侧链裂解酶Cyp11a1、3β-羟基类固醇脱氢酶1和胰岛素样因子3等均显著下调，这些标志物的下降也表明Leydig细胞活性受到抑制。PAEs对Leydig细胞功能的抑制作用已形成共识，但事实上，仅高剂量的PAEs会有抑制效应，降低睾酮合成途径相关酶的基因和蛋白表达[23]，而低剂量的PAEs会促进睾酮的合成[24]。不同的PAEs对Leydig细胞的影响程度也不同，含4～5个碳原子烷基链的单酯对睾酮的抑制作用最强，而含0～2个碳原子的最弱[25]。此外，PAEs对Leydig细胞的作用还具有种属差异，人类和小鼠的敏感性不如大鼠[26-27]。

3PAEs对Leydig细胞的作用机制

PAEs对Leydig细胞的作用机制是近年来研究的热点，但目前仍未被完全阐明。现在被人们普遍接受的观点是，PAEs通过干扰胆固醇的调节降低睾酮的生成量。Leydig细胞可直接由血中摄取胆固醇，在线粒体内膜上转换为孕烯醇酮，进而转化为有活性的雄激素。在胆固醇向线粒体内膜转运及雄激素合成过程中有很多关键蛋白的参与，如B类1型清道夫受体、类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)、3β-羟基类固醇脱氢酶、细胞色素P450 17A1等。其中B类1型清道夫受体蛋白促进胆固醇进入产睾酮细胞；StAR作为转运蛋白使胆固醇进入线粒体膜；3β-羟基类固醇脱氢酶是将孕烯醇酮转化为睾酮的关键酶；细胞色素P450 17A1则是睾酮合成酶，将孕酮转化为雄烯二酮。有研究发现，DEHP及其代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯的暴露会使Leydig细胞内的StAR、Cyp11a1表达下降[20]，DBP也会产生相同的作用[10]。Cyp11a1编码生成细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶P450scc，后者参与睾酮生成的第一步酶促反应，将胆固醇转化为孕烯雌酮[20]，由此推断，PAEs通过干扰胆固醇的转运和抑制第一步酶促反应影响睾酮的生成。Johnson等[28]也通过实验证明，Leydig细胞生成睾酮的急剧衰减是由于胆固醇转运、睾酮合成路径相关酶的信使RNA和蛋白(StAR、Cyp11a1等)表达下降；同时，还发现固醇调节元件结合蛋白2表达下降，固醇调节元件结合蛋白2是控制FLCs胆固醇和甾体代谢的基因转录因子之一，其活性下降在PAEs的作用机制中也可能起关键作用。类固醇生成因子1的活性对FLCs生成睾酮过程中很多蛋白的表达有影响，对男性生殖功能和发育起重要作用，因此，类固醇生成因子1活性下降同样被认为是PAEs的作用机制之一[29]。进一步研究发现，睾酮生成的最初机制可能是鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ对睾酮生成抑制作用的解除，而不是由旁分泌直接刺激睾酮生成；DBP能够诱导鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ在FLCs内重新表达，和类固醇生成因子1竞争性地结合于编码睾酮合成酶基因的启动子序列交叉反应元件，导致StAR、细胞色素P450 17A1表达下降，影响睾酮的生成[30]。另外，邻苯二甲酸单-2-乙基己酯还能特异性结合于细胞色素P450 17A1，从而抑制睾酮的合成[31]。氧化应激损伤是另一个重要的作用机制[32]。美国一项研究发现，一般人群尿液样品中几种PAEs的代谢产物与血液中炎症、氧化应激的标志物具有显著相关性[33]。其他一些研究也发现，PAEs能使细胞中活性氧簇水平上升，导致氧化应激，并通过脂质过氧化作用及损伤细胞中的遗传物质等方式，对细胞及机体造成氧化损伤[32,34-35]。另外，PAEs能直接作用于Leydig细胞，刺激Leydig细胞的早期增生并延长抑制其分化可能是PAEs对Leydig细胞的作用机制之一，最终影响其功能[22,36-37]。而Lee等[38]对Leydig细胞增生机制进行研究后发现，PAEs能使睾丸内的磷脂酶D显著增高，而在其他器官(如肝脏、精囊、前列腺等)则无明显变化，提示PAEs可能通过产生活性氧或其他应激引导激活磷脂酶D，从而导致睾丸Leydig细胞的增生。而雌二醇也被认为能介导PAEs对Leydig细胞的毒性作用，PAEs会导致睾丸内多种蛋白表达改变，其中一些蛋白符合雌二醇调节的通路网络[19]，但具体的作用机制还不清楚。综上所述，PAEs对Leydig细胞的可能作用机制有：①干扰胆固醇向线粒体膜的转运；②影响胆固醇向睾酮转化的酶促反应；③干扰睾酮合成酶信使RNA的表达；④鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅱ竞争性地抑制类固醇生成因子1及其下游相关蛋白；⑤氧化应激损伤；⑤抑制Leydig细胞分化；⑦其他。这些机制是近几年研究的热点，但有些还不够完善，有待以后进一步的研究。另外，在研究过程中，一些对Leydig细胞的保护机制也被发现，如DBP作用于大鼠后，过氧化物酶6主要定位于胎鼠睾丸的Leydig细胞中，其可能通过发挥抗氧化作用及刺激Leydig细胞增殖，抵抗PAEs的毒性作用[39]。而转录因子NF-E2相关因子2在Leydig细胞氧化应激的过程中则能够通过核聚集起到保护作用[40]。

4小结

学者们在研究过程中应用了很多新的实验模型和方法，如用于体外实验的R2C细胞[25]、大鼠MA-10间质细胞[32,34]和小鼠睾丸间质瘤MLTC-1细胞[23]等，均有很高的价值。利用乙烷二甲烷磺酸盐消除成熟大鼠睾丸内的ALCs，诱导其再生，避免了大鼠青春期内分泌变化的干扰[15,22,36]。而将人类胎儿睾丸移植入免疫缺陷的啮齿类宿主中并暴露于DBP，可以为研究PAEs对人类Leydig细胞的作用提供载体[26]。借助这些新的方法，研究PAEs对Leydig细胞作用机制的同时，积极探索Leydig细胞的保护机制，将是以后研究的重点。

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Leydig Cell Influence during the Process of Phthalate Acid Esters-Induced HypospadiasJIANGXu-ping1,SHENBai-xin2,ZHANGWei1.(1.DepartmentofUrology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China；2.DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011,China)

Abstract:Hypospadias gains more and more attention recently and phthalate acid esters(PAEs),which is widespread in the environment and affects human health seriously,especially the male fertility system,is considered as one of the effect factors.Leydig cell is one of the target cells of PAEs,but the mechanism is still unclear.Here is to make a review of the recent findings about PAEs effects on Leydig cell,and how Leydig cell is affected in the course of phthalate-mediated hypospadias,so as to provide new ideas for the further study and exploration.

Key words:Phthalate acid esters； Hypospadias； Leydig cell

收稿日期：2014-10-08修回日期：2014-12-03编辑：郑雪

基金项目：国家自然科学基金(81370781)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.001

中图分类号：R691

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)14-2497-03