李小林 武密山 朱紫薇 邓勇存 叶圆圆 赵素芝 任立中 王 茹 白 霞 韩红伟 李 彬

(河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000)

地黄对去卵巢骨质疏松大鼠腰椎骨组织整合素 β1 mRNA表达的影响

李小林 武密山1朱紫薇2邓勇存2叶圆圆2赵素芝3任立中4王 茹1白 霞1韩红伟1李 彬5

(河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000)

目的 探讨地黄对去卵巢骨质疏松大鼠股骨骨密度、腰椎骨组织整合素β1 mRNA表达的影响。方法 72只雌性大鼠，随机分为假手术组、模型组、雌二醇组和地黄小、中、大剂量组。假手术组仅行假手术，其余五组行卵巢切除术。术后1 w分别灌胃给予17β-雌二醇和地黄小、中、大剂量，连续给药3个月。测定血钙、磷和碱性磷酸酶(ALP)，尿钙(u-Ca)、磷、尿脱氧吡啶酚(D-Pyr)和肌酐(Cr)。之后处死动物，取出右侧股骨，测定骨密度;取出第2腰椎，测定骨钙(b-Ca)、磷(b-P)含量;取出第4腰椎，采用实时荧光逆转录聚合酶链反应测定腰椎骨整合素 β1 mRNA表达。结果 与假手术组相比，模型组血清 ALP、u-Ca、D-Pyr/Cr显著增加，股骨密度、腰椎骨整合素β1 mRNA表达均降低。与模型组比较，地黄中、大剂量组和雌二醇组均可使血清ALP、u-Ca、D-Pyr/Cr排出量降低，股骨密度、腰椎骨整合素β1 mRNA表达均增加。结论 地黄能抑制由于去卵巢雌激素缺乏引发的骨转换增强，提高骨密度，促进腰椎骨组织整合素β1 mRNA表达，增强骨质量。

骨质疏松;地黄;骨密度;腰椎骨整合素

地黄 (Radix Rehmanniae)是玄参科植物地黄的块根，是常用的滋阴中药，其化学成分主要有环烯醚萜类和糖类，其中环烯醚萜类又以梓醇 (Catalpol)含量较高，为地黄中主要活性成分之一〔1〕。已往的研究表明，以地黄为主组成的补肾方药具有明显的抗骨质疏松活性〔2，3〕，提取地黄的主要活性成分梓醇可促进小鼠成骨细胞增殖、分化和矿化〔4〕。近年研究表明，整合素 (Itg)β1与成骨细胞活性密切相关〔5〕，尿脱氧吡啶酚 (D-Pyr)是目前最特异的骨吸收指标〔6〕。本实验通过观察地黄对大鼠股骨骨密度、骨组织 Itg β1 mRNA表达的影响，探讨地黄防治去卵巢骨质疏松大鼠骨丢失和骨质量下降的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 动物、主要仪器与试剂 3月龄SPF级雌性SD大鼠72只，体质量(264±15)g，由河北省实验动物中心提供〔许可证号:SCXK(冀)2003-1-003〕。Lunar-XR型双能X线骨密度测定仪(美国Lunar公司产品)，RG-3000 Real-time PCR仪(澳大利亚Corbett Research公司)，美国MIS-2000 SP型3Y显微图像分析仪，SYBR GreenⅠ荧光染料(美国 Biotium公司)，Trizol总RNA提取试剂盒(Takara公司)，cDNA逆转录试剂盒(Fermentas公司)，Taq DNA 聚合酶、dNTP(MBI公司)。17β-雌二醇(17β-E2，Sigma公司产品)，钙、磷试剂盒、肌酐试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司产品)。地黄一次性购自石家庄市乐仁堂，药材经河北医科大学中药鉴定教研室鉴定为地黄，是玄参科植物地黄的块根，加8倍量水，共同浸泡40 min，煮沸后文火煎煮 60 min，滤出药液;药渣加2倍水量继续煎煮40 min，合并两次滤液，水浴浓缩，每1 ml药液含生药 5.5 g。

1.2 造模与分组 健康3月龄SD雌性大鼠72只，随机分为假手术组、模型组、雌二醇组和地黄小、中、大剂量组，每组12只。将动物乙醚麻醉，腰背部两侧剪毛，75%乙醇消毒，假手术组大鼠从背部切口，找到卵巢后，只切除少量脂肪组织后缝合;其他各组均参照本实验室的背驮式方法〔2〕从背侧切口摘除双侧卵巢，缝合伤口，然后涂以红霉素软膏抗感染，于卵巢切除1 w后，给大鼠灌胃给药:地黄小剂量组大鼠灌胃给予1.25 ml/kg地黄混悬液，地黄中剂量组大鼠灌胃给予2.5 ml/kg地黄混悬液，地黄大剂量组大鼠灌胃给予5 ml/kg地黄混悬液，对照组大鼠灌胃给予雌二醇混悬液(2 mg/kg)，假手术组和模型组分别灌胃给予等体积(5 ml/kg)的蒸馏水。连续给药3个月后，腹主动脉取血，离心，分离出血清;取大鼠的第2、4腰椎和股骨，小心剥离，去除表面软组织，保留完整骨膜，冷生理盐水纱布冷藏保存。

1.3 骨密度(BMD)测定 取右侧股骨，按文献〔7〕分别测出股骨整体、股骨近端(股骨近侧干骺端1/3)、股骨远端(股骨远侧干骺端1/4)BMD，最终以平均值计。

1.4 骨钙(b-Ca)、骨磷(b-P)含量测定 取第2腰椎，用10%三氯醋酸3 ml脱钙3次，每次24 h，合并脱钙液，取适量，用乙二胺四乙酸(EDTA)法测钙，计算单位骨体积的含钙量;用硫酸亚铁法测磷，计算单位骨体积的含磷量。

1.5 尿钙(u-Ca)、尿磷(u-P)、尿脱氧吡啶酚和肌酐(Cr)检测实验结束前1 d，用大鼠代谢笼收集大鼠24 h尿液，记录尿量。用ELISA法测定D-Pyr的量，用全自动生化分析仪测定尿中钙、磷和肌酐的量。

1.6 血清钙(s-Ca)、血清磷(s-P)和ALP分析 大鼠用乙醚麻醉后，腹主动脉取血，离心，分离血清，用全自动生化分析仪测定s-Ca、s-P和ALP的活性。

1.7 子宫 取大鼠的子宫，迅速称量，计算子宫脏器系数。

1.8 腰椎Itg β1 mRNA表达的检测 引物由上海博亚生物工程公司依据GenBank数据库获得基因序列合成。引物序列:正义 5′-ACC ACG ATT GTG ACT TTG TC-3′，反义 5′-CTC CCT CTG ATC ATC TCC GT-3′，扩增片段长度为 285 bp。β-actin引物序列:正义 5′-CGC GGC ACG TTG ATG TCA TG-3′，反义:5′-ATG TTA CGC TGT CCC TGT TG-3′，扩增片段长度为216 bp。①总RNA提取:采用 Trizol一步法提取腰椎总 RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，A260/A280均在1.8～2.0。总RNA 浓度=OD260 值×8(μg/μl)，用前调整浓度至 1 μg/μl。②在逆转录酶M-MLV的作用下，将mRNA逆转录成cDNA分子，反应体系:H2O 5.5 μl，Oligo(dT 18)1.0 μl，tRNA 6.0 μl，Rnasin 0.5 μl，5×buffer 4.0 μl，10 mmol/L dNTP 2.0 μl，RTase 1.0 μl，反应条件:42℃ 60 min，95℃ 5 min。③荧光定量 PCR反应体系:cDNA 1 μl，10 ×buffer 5.0 μl，MgCl2(25 mmol/L)7.0 μl，10 mmol/L dNTP 1.0 μl，Primer F(20 pmol/μl)各0.8 μl，SYBR GreenⅠ1 μl，Taq 酶(5 U/μl)0.5 μl。反应条件:94℃ 30 min，94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s，50 个循环。Cycle threshold(Ct)值的计算分析:待测样品相对值 =2-△△Ct，△Ct=Ct阴性对照-Ct待测样品，△△Ct=△Ct β-actin-△Ct待测样品。

1.9 统计学方法 应用SPSS11.0软件行单因素方差分析。

2 结果

2.1 对股骨BMD，b-Ca、b-P含量的影响 与假手术组比较，模型组股骨 BMD、b-Ca、b-P含量明显降低(P＜0.01)。与模型组相比，地黄中剂量组、地黄大剂量组、雌二醇组的股骨 BMD、b-Ca、b-P含量显著增加(P＜0.01);地黄小剂量组的股骨 BMD、b-Ca、b-P含量无显著增加(P＞0.05)。地黄中、大剂量组与雌二醇组之间无明显差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠股骨BMD、b-Ca、b-P含量(±s，n=12)

表1 各组大鼠股骨BMD、b-Ca、b-P含量(±s，n=12)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜ 0.01，下表同

组别 股骨(g/cm2)第2腰椎b-Ca(mg/cm3) b-P(mg/cm3)0.198±0.017 0.365±0.013 0.134±0.003模型组 0.162±0.0161) 0.327±0.0151) 0.123±0.0051)雌二醇组 0.192±0.0172) 0.362±0.0222) 0.134±0.0062)地黄小剂量组 0.172±0.018 0.331±0.023 0.125±0.007地黄中剂量组 0.191±0.0172) 0.357±0.0252) 0.133±0.0082)地黄大剂量组 0.192±0.0182) 0.358±0.0242) 0.134±0.0062)假手术组

2.2 对u-Ca、u-P和D-Pyr/Cr的影响 与假手术组比较，模型组 u-Ca、D-Pyr/Cr显著增加(P＜0.01)，u-P 无明显变化(P＞0.05)。与模型组相比，地黄中剂量组、地黄大剂量组、雌二醇组 u-Ca、D-Pyr/Cr显著减少(P＜0.01)，u-P 无明显变化(P＞0.05);地黄小剂量组 u-Ca、D-Pyr/Cr含量无显著增加(P＞0.05)，u-P 无明显变化(P＞0.05)。见表2。

2.3 对s-Ca、s-P、ALP和子宫脏器系数的影响 与假手术组比较，模型组血清ALP显著增加(P＜0.01)，子宫脏器系数降低(P＜0.01)，s-Ca 、s-P 无明显变化(P＞0.05)。与模型组相比，地黄中剂量组、地黄大剂量组、雌二醇组 ALP活性显著降低(P＜0.01)，地黄中剂量组、地黄大剂量组子宫脏器系数无显著增加(P＞0.05)，雌二醇组的子宫脏器系数升高(P＜0.01)，各组s-Ca、s-P无明显变化(P＞0.05);地黄小剂量组 ALP活性无显著降低(P＞0.05)，子宫脏器系数无显著增加(P＞0.05)。见表3。

表2 地黄对各组大鼠u-Ca、u-P和D-Pyr/Cr的影响(±s，n=12)

表2 地黄对各组大鼠u-Ca、u-P和D-Pyr/Cr的影响(±s，n=12)

组别D-Pyr/Cr(mmol/mg)u-Ca(mg/mg)u-P(mg/mg)4.81±0.62 0.82±0.14 1.84±0.16模型组 8.65±0.711) 1.34±0.171) 1.71±0.18雌二醇组 5.38±0.762) 0.89±0.172) 1.75±0.19地黄小剂量组 4.95±0.64 1.01±0.15 1.76±0.18地黄中剂量组 5.26±0.732) 0.85±0.192) 1.78±0.16地黄大剂量组 5.32±0.782) 0.84±0.212)假手术组1.77±0.17

表3 地黄对各组大鼠s-Ca、s-P、ALP和子宫脏器系数的影响(±s，n=12)

表3 地黄对各组大鼠s-Ca、s-P、ALP和子宫脏器系数的影响(±s，n=12)

组别 子宫/体重(mg/g)ALP(U/L)s-Ca(mg/L)s-P(mg/L)1.86±0.10 74.13±9.64 11.03±0.21 3.09±0.12模型组 0.42±0.081)99.24±8.521)10.37±0.16 3.14±0.15雌二醇组 1.13±0.062)76.25±8.132)10.44±0.18 3.15±0.17地黄小剂量组 0.47±0.071)88.28±10.12 10.43±0.16 3.13±0.16地黄中剂量组 0.45±0.051)75.26±9.132)10.64±0.15 3.12±0.13地黄大剂量组 0.44±0.061)74.53±10.252)假手术组10.53±0.18 3.10±0.15

2.4 对腰椎Itg β1 mRNA表达的影响 与假手术组(1.71±0.16)比较，模型组 Itg β1 mRNA 表达(1.49±0.15)明显降低(P＜ 0.01)。与模型组相比，地黄中剂量组(1.73±0.16)、地黄大剂量组(1.74±0.17)、雌二醇组(1.72±0.14)Itg β1 mRNA 表达显著增加(P＜0.01);地黄小剂量组 Itg β1 mRNA 表达(1.57±0.17)无显著增加(P＞0.05)。地黄中、大剂量组与雌二醇组之间比较无明显差异(P＞0.05)。

3 讨论

绝经后妇女卵巢功能减退，雌激素水平降低，骨吸收亢进，造成骨质流失，与老龄造成的低转化型骨质疏松相比，绝经后妇女骨质疏松属于高转化型骨质疏松。临床观察绝经后妇女血清ALP活性升高，u-Ca、尿D-Pyr排出量增加，骨吸收强于骨形成〔8〕。骨基质中90%是骨胶纤维，胶原吡啶交联包括吡啶酚(Pyr)和D-Pyr两种成熟的交联氨基酸，D-Pyr只存在于骨骼和牙质的Ⅰ型胶原中，因牙质转换速度慢，在整体骨骼所占的份额极小，故尿中的D-Pyr几乎全来自矿化骨的骨吸收。研究发现Pyr和D-Pyr在绝经时增加50% ～100%，经雌激素治疗后可降至绝经前水平，并在绝经两年的追踪研究后发现，D-Pyr与骨丢失率显著相关〔9〕。本实验采用去卵巢大鼠模拟绝经后妇女骨质疏松，结果显示，去卵巢后大鼠血清ALP活性增加，u-Ca、D-Pyr/Cr排出显著增加，与绝经后妇女骨质疏松患者的临床生化指标的变化一致。ALP反映成骨细胞的成骨活性〔10〕，本研究通过卵巢切除人为地造成卵巢功能破坏，雌激素水平下降，骨吸收代谢加强，骨基质中的Ⅰ型胶原分解加速，骨丢失率显著上升，造成雌激素缺乏引起的骨转换亢进骨质疏松病理模型;并且与雌二醇组相比，长期服用地黄对子宫没有刺激增生的作用。

Itg是一组细胞表面跨膜糖蛋白，由α、β两个亚单位以非共价键结合构成异二聚体。Itg由胞内区、胞外区和跨膜区3部分组成，其膜外部分可识别配体，如纤维黏连蛋白、尿黏连蛋白和胶原等，而胞内端除可与细胞骨架等结构蛋白结合外，还可与多种信号蛋白如局部黏附蛋白、Itg连接激酶、蛋白激酶 C等结合，在细胞内外信号转导中发挥重要作用〔11〕。Itg β1在细胞的锚定、生长、增殖、分化等方面起着重要作用〔12〕。Itg是细胞表面跨膜蛋白，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)间黏附作用，参与细胞的信号传递和功能调控。Itg β1亚基是占比例最大的Itg家族，在骨组织中广泛存在，成骨细胞(OB)Itg的表达水平影响其与ECM的结合能力〔13〕，OB的成骨功能与其Itg的表达水平密切相关〔5〕。OB在Itg β1的介导下，与多种骨基质蛋白(如Ⅰ型胶原、纤维黏连蛋白、玻璃黏连蛋白等)结合，激活细胞内黏着斑激酶(FAK)活性，引起细胞形态改变、细胞骨架重建、细胞有丝分裂活性提高，促进成骨细胞分化、成熟〔14〕。ECM→整合素→黏着斑激酶→细胞骨架，构成了Itg信号转导通路，将细胞外信息传递到细胞内，调控基因表达，行使功能〔15〕。Itg结合配体后，胞内的黏着斑激酶(FAK)被激活，引起细胞形态改变，细胞骨架重建，促进OB分化、成熟，细胞外的信息，就通过配体→Itg→FAK传入细胞内。Itg β1表达的减少，或者与配体结合的减少，均导致OG功能的减退〔16〕。

实验结果显示，模型组骨组织中Itg β1 mRNA表达低于假手术组，提示卵巢切除后OB与ECM黏附能力下降，OB的成骨活性不足。用药后，地黄组骨组织中Itg β1 mRNA表达水平明显增加。一方面提示OB与ECM的黏附能力增强，使OB的成骨活性提高;另一方面由于Itg是理想的信号转导分子，Itg β1 mRNA表达可能通过相关信号的转导，促进OB增殖与分化，延缓Itg的凋亡，使OB数量增加，从而扭转了因雌激素下降出现的成骨不足病理态势。

1 刘卫欣，卢兖伟，杜海涛，等.地黄及其活性成分药理作用研究进展〔J〕.国际药学研究杂志，2009;36(4):277-80.

2 武密山，李 恩，赵素芝，等.抗骨松颗粒对去卵巢大鼠骨质含量和生物力学的影响〔J〕.中国老年学杂志，2008;28(23):2289-92.

3 武密山，赵素芝，任立中，等.密骨打老儿丸含药血清对共育体系中成骨细胞和破骨细胞功能的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2013;29(5):913-7.

4 武密山，赵素芝，李 恩，等.地黄活性成分梓醇对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响〔J〕.中国药理学通报，2010;26(4):509-13.

5 Maggi M，Barni T，Orlando C，et al.Endothelin-1 and its receptors in human testis〔J〕.J Androl，1995;16(3):213-24.

6 Hanson DA，Weis MA，Bollen AM，et al.A specific immunoassay for monitoring human bone resorption:quantitation of type I collagen crosslinked N-telopeptides in urine〔J〕.J Bone Miner Res，1992;7(11):1251-8.

7 Parfitt AM，Drezner MK，Glorieux FH，et al.Bone histomorphometry:standardization of nomenclature，symbols，and units.Report of the ASB-MR histomorphometry nomenclature committee〔J〕.J Bone Miner Res，1987;2(6):595-610.

8 武密山，赵素芝，李 恩.抗骨松穴位贴剂对原发性骨质疏松防治作用的临床研究〔J〕.中医研究，2001;14(1):26-8.

9 Uebelhart D，Schlemmer A，Johansen JS，et al.Effect of menopause and hormone replacement therapy on the urinary excretion of pyridinium cross-links〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，1991;72(2):367-73.

10 Effenberger KE，Johnsen SA，Monroe DG，et al.Regulation of osteoblastic phenotype and gene expression by hop-derived phytoestrogens〔J〕.J Steroid Biochem Mol Biol，2005;96(5):387-99.

11 Clark EA，Brugge JS.Integrins and signal transduction pathways:the road taken〔J〕.Science，1995;268(5208):233-9.

12 Gronthos S，Stewart K，Graves SE，et al.Integrin expression and function on human osteoblast-like cells〔J〕.J Bone Miner Res，1997;12(8):1189-97.

13 Manduca P，Pistone M，Sanguineti C，et al.Modulation of integrins expression during human osteoblasts"in vitro"differentiation〔J〕.Boll Soc Ital Biol Sper，1993;69(11):699-704.

14 Reyes CD，García AJ.Alpha 2 beta 1 integrin-specific collagen-mimetic surfaces supporting osteoblastic differentiation〔J〕.J Biomed Mater Res A，2004;69(4):591-600.

15 Duong LT，Nakamura I，Lakkakorpi PT，et al.Inhibition of osteoclast function by adenovirus expressing antisense protein-tyrosine kinase 2〔J〕.J Biol Chem，2001;276(10):7484-92.

16 Cheng SL，Lai CF，Fausto A，et al.Regulation of alpha V beta3 and alpha V beta5 integrins by dexamethasone in normal human osteoblastic cells〔J〕.J Cell Biochem，2000;77(2):265-76.

The experimental study of the effects of Radix Rehmanniae on the expression of the forth lumbar vertebrae osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA in ovariectomized osteoporosis model rats

LI Xiao-Lin，WU Mi-Shan，ZHU Zi-Wei，et al.
Department of Traditional Chinese Medicine，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，Hebei，China

ObjectiveTo explore the influence of Radix Rehmanniae on bone mineral density(BMD)of femur，the expression of the forth lumbar vertebrae osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA in ovariectomized osteoporosis model rats .Methods72 Sprague Dawley female rats were randomly divided into sham，model，17 β-estrogen treated and Radix Rehmanniae treated groups(1.25，2.5，5 ml/kg).The sham group was only sham operated and the other five groups were ovariectomized respectively.One week after ovariectomy，the rats were given Radix Rehmanniae(1.25，2.5，5 ml/kg)and 17 β-estrogen(2 mg/kg)by intragastric administration for three months sustainedly.Serum contents of calcium(s-Ca)，phosphorus(s-P)，alkaline phosphate(ALP)and levels of urinary deoxypyridinoline(D-Pyr)，urine contents of calcium(u-Ca)，phosphorus(u-P)and creatinine(Cr)were detected.Rats were sacrificed at the end of the experiment.The thighbone was taken out to determine bone mineral density(BMD).The second lumbar vertebra was taken out to determine contents of calcium(b-Ca)and phosphorus(b-P).The forth lumbar vertebrae(LV4)was taken out to FQ-PCR for testing the expression of forth lumbar vertebra osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA.ResultsCompared with those of sham group，serum ALP activity as well as u-Ca and urinary D-Pyr/Cr significantly were increased in ovariectomized rats.BMD of femur，and the expression of the forth lumbar vertebra osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA was significantly decreased in model group.Compared with that of model group，middle and high doses of Radix Rehmanniae and 17 βestrogen inhibited serum ALP activity inhibit，and u-Ca，urinary D-Pyr/Cr reduce.BMD of femur，and the expression of the forth lumbar vertebra osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA were increased in middle and high doses of Radix Rehmanniae groups.ConclusionsRadix Rehmanniae could inhibit the high rate of turn-over induced by ovariectomy in rats，significantly raise BMD of the thighbone and improve the expression of the forth lumbar vertebra osseous integrin beta 1(Itg β1)mRNA，and activate bone metabolism to reinforce quality of the bone.

Osteroporosis;Radix Rehmanniae;Bone mineral density(BMD);Osseous integrin beta 1(Itg β1)

李小林(1957-)，女，副主任医师，主要从事中药治疗风湿骨病作用机制研究。

R151.2

A

1005-9202(2015)09-2319-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.007

国家自然科学基金资助项目 (81073074，30472200);河北省自然科学基金项目(H2013206005);河北省留学人员科技活动项目择优资助项目 (200828);河北省大学生创新创业训练计划项目(201310089062)

1 河北中医学院方剂学教研室

2 河北中医学院2011级中医学专业

3 石家庄市桥东区胜北社区卫生服务中心

4 河北医科大学第一医院骨科 5 河北医科大学生物化学教研室

武密山 (1966-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事补肾中药治疗骨质疏松作用机制研究。

〔2013-11-26修回〕

(编辑 袁左鸣)