巫亮，李荣鹏，訾小利，胡南

摘要：从盐城市射阳盐场分离筛选出的一株中度嗜盐兼性厌氧海杆菌（Marinobacter）NY-9，该菌在厌氧及好氧条件下均表现出高效的反硝化能力。研究考察了厌氧及好氧条件下盐度对一株海杆菌NY-9生长及反硝化能力的影响。结果表明，菌株该菌株的厌氧及好氧生长盐浓度范围分别为0%～16%及0%～12%，最适生长盐度均为8%，该盐度下培养72 h，OD600 nm值分别达到了0.38及1.12。在最适盐度条件下，该菌株均取得了最高的厌氧及好氧反硝化效率，在NO3-起始浓度为100 mg/L的反硝化溶液中培养72 h，其总氮去除率分别达到了87.6%及62.5%。

关键词：反硝化;高盐废水;海杆菌（Marinobacter）;耐盐性

中图分类号：Q935        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5705-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.021

生物脱氮是去除废水中氮素污染的有效技术之一，生物脱氮工艺因具有处理效果好、处理成本低、操作管理方便等优点而得到广泛的应用[1-3]。在石油、化工、海产品养殖等行业中，排除的含氮废水大多是高盐含氮废水。然而，传统的生物脱氮工艺难以处理高盐废水。高盐废水是指总盐质量浓度超过10 g/L的废水[4]，由于高盐废水中含有大量的Cl-、SO42-、Na+、Ca2+等离子，其渗透压较高，超出了微生物细胞质和细胞膜所能承受的压力范围，对于微生物的生长有一定的影响，因此高盐废水对常规的生物脱氮工艺中微生物的代谢起着抑制作用[5]。盐度升高时，水的渗透压也随之升高，非嗜盐微生物的细胞会发生质壁分离，从而抑制微生物的生长繁殖和新陈代谢，甚至导致死亡[6]。因此，利用生物脱氮法处理高浓度的含盐废水时，需要进行稀释使盐浓度降低，然而这会造成水资源的浪费，成本增大，同时，难以使出水达到废水排放标准的要求，因此影响了海水直接利用的范围和程度。

海杆菌（Marinobacter）是目前国外报道较多的一类能够耐高盐环境的反硝化微生物[7-9]，具有潜在的工业应用价值，本实验室也曾在盐城市的新滩盐场分离到一株海杆菌NY-4，最适生长的盐度为8%[10]。本研究报道了一株从盐城市射阳盐场分离筛选出的海杆菌NY-9在不同盐浓度反硝化能力的变化，以期为实现海杆菌在高盐废水生物脱氮上的工业应用提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  菌株来源及种类

菌株从盐城市射阳盐场分离筛选得到，能耐受一定盐浓度，在厌氧和好氧条件下有较好的反硝化效果，命名为NY-9。结合NY-9的菌落形态特征、生理和生化特征，将所测16S rDNA序列通过 BLAST比对，鉴定其为海杆菌。

1.2  培养基

高盐的LB培养基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 80.0 g，KCl 5.0 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，加去离子水定容至1 L，调节pH 7.0～7.5，121 ℃湿热灭菌20 min。

高盐反硝化培养基：NaNO3 0.6 g，柠檬酸三钠 4.1 g，NaCl 80.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO4 1.5 g，微量元素溶液1 mL，加去离子水定容至1 L，调pH到7.0～7.5，121 ℃湿热灭菌20 min。

微量元素溶液：Na2EDTA 63.7 g，ZnSO4 2.2 g，CaCl2 5.5 g， MnCl2·4H2O 5.1 g，FeSO4·7H2O 5.0 g，Na2MoO4·4H2O 1.1 g，CuSO4·5H2O 1.6 g，CoCl2·6H2O 1.6 g，加去离子水定容至1 L，调pH 7.0。

1.3  不同盐度下菌株NY-9生长及反硝化能力的测定

1.3.1  厌氧条件下不同盐度下菌株NY-9生长及反硝化能力测定  在250 mL的三角瓶中，装入150 mL的反硝化培养液，培养液的盐度分别设为0%、4%、8%、12%和16%，121 ℃灭菌20 min。接入培养至对数期的细菌菌液，使其初始的OD600 nm值为0.1，在培养液的上方加入已灭菌的液体石蜡进行液封，隔绝空气，用封口膜封口，30 ℃静置培养72 h。每组设3个平行，每隔12 h取样2 mL，测定培养液中的OD600 nm、NO3--N、NO2--N和TN的浓度。

1.3.2  好氧条件下不同盐浓度下菌株NY-9生长及反硝化能力测定  在500 mL的三角瓶中，装入200 mL的反硝化培养液，培养液的盐度分别设为0%、4%、8%、12%和16%，保持C/N为10，121 ℃灭菌20 min。接入培养至对数期的细菌菌液，使其初始的OD600 nm值为0.1，30 ℃、120 r/min摇床振荡培养72 h。每组设3个平行，每隔12 h取样2 mL，测定培养液中的OD600 nm、NO3--N、NO2--N和TN的浓度。

1.4  分析方法

菌体生长测定采用比浊法（OD600 nm），硝酸盐氮（NO3--N）的测定采用紫外分光光度法（参考标准HZ-HJ-SZ-0138），亚硝酸盐氮（NO2--N）的测定采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法（参考国家标准GB 7493-1987），总氮（TN）的测定采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法（参考国家标准GB 118

94-1989）。

2  结果与分析

2.1厌氧条件下盐度对菌株NY-9生长及反硝化能力的影响

2.1.1  厌氧条件下盐度对菌株NY-9生长的影响 从图1可以看出，随着盐度的增加，菌体的生长呈现先增加后减少的趋势。盐度为0%时菌体生长72h的OD600 nm为0.16，盐度为8%时菌体的OD600 nm达到最大，为0.38。盐度继续增加，菌体的OD600 nm迅速降低，盐度为16%时菌体的OD600 nm为0.23。

2.1.2  厌氧条件下盐浓度对菌株NY-9反硝化能力的影响  由图2、图3可知，随着盐度的增加菌株NY-9的脱氮率呈现先增加后降低的趋势。菌株NY-9在盐度为4%、8%和12%时均有好的脱氮效果，脱氮率分别为43.5%、87.6%和52.6%，整个过程中没有NO2--N的积累。因此，菌株NY-9在盐度为8%的培养基中的脱氮率最高，这一结果与Yoshie等[11]的试验结果比较相近。Yoshie等从处理含高盐废水的活性污泥中筛选出菌株Halomonas sp.，该菌株在反应器中进行反硝化作用的最适盐度为7%。菌株NY-9在不含盐的环境中的生长量较小导致该菌株几乎没有反硝化作用。在盐度为12%时菌株NY-9的菌体生长和反硝化效果均呈下降趋势，盐度增加到16%后，菌体的生长和脱氮率都受到明显的抑制。因为盐度过高会使溶液的渗透压增高，从而使微生物细胞脱水导致细胞发生原生质分离，最终影响菌体的生长和脱氮效果[12]。

2.2  好氧条件下盐度对菌株NY-9生长及反硝化能力的影响

2.2.1  好氧条件下盐度对菌株NY-9生长的影响 从图4可以看出，好氧条件下，随着盐度的增加，菌体生长呈现先增加后减小的趋势。盐度为0%时菌体生长72 h的OD600 nm为0.19，盐度为8%时菌体OD600 nm达到最大，为1.12。盐度继续增加，菌体的OD600nm迅速降低，盐度为16%时菌体几乎不生长。可知菌株NY-9在盐度为0%～12%均可生长，最适盐度为8%。

2.2.2  好氧条件下盐度对菌株NY-9反硝化能力的影响  从图5、图6可知，菌株NY-9在盐度为8%时的总氮去除率最高，可达到62.5%，盐度为4%和12%时的脱氮率分别为52.7%和44.5%，整个过程中没有NO2--N的积累。菌株盐度为16%时，菌体几乎不生长，由于菌株的脱氮活性与菌株的生长密切相关，因此，NY-9在盐度为16%时也几乎没有反硝化作用。因此，选择盐度为8%作为菌株NY-9进行好氧反硝化的最适盐度。

3  结论

本研究从盐城市射阳盐场分离出一株中度嗜盐海杆菌NY-9，在厌氧条件下，菌株NY-9能在盐度为0%-16%的培养液中生长，在盐度为4%、8%和12%均有较好的脱氮效果，脱氮率分别为43.5%、87.6%和52.6%。好氧条件下，菌株NY-9能在盐度为0%-12%的培养液中生长，同样，在盐度为8%时总氮的去除率最高，可达到62.5%。上述结果表明海杆菌NY-9在高盐废水的厌氧、好氧脱氮处理中具有很好的应用前景。

参考文献：

[1] KENNISH M J. Environmental threats and environmental fu ture of estuaries [J]. Environ Conserv，2002，29（7）：78-107

[2] 李  军，杨秀山，彭永臻.微生物与水处理 [M ] 北京： 化学工业出版社，2002.

[3] MORENO B，G？魷MEZ M A， GONZ？魣LEZ-L？魷PEZ J，et al. Inoculation of a submerged filter for biological denitrification of nitrate polluted groundwater： a comparative study [J]. Journal of Hazardous Materials，2005，117（2-3）：141-147.

[4] 雷  云，解庆林，李艳红.高盐度废水处理研究进展[J].环境科学与管理，2007，32（6）：94-98.

[5] KUNTE H J， CRANE R A， CULHAM D E，et al.Protein proQ influences osmotic activation of compatible solute transporter proP in Escherichia coli K-12[J]. Bacteriol，1999，181（5）： 1537-1543.

[6] 刘  正.高浓度含盐废水生物处理技术[J].化工环保，2004，24（增刊）：209-211.

[7] CATON T M， WITTE L R， NGYUEN H D， et al. Halotolerant aerobic heterotrophic bacteria from the greatsalt plains of oklahoma [J]. Microbial Ecology， 2004， 48：449-462.

[8] SHAPOVALOVA A A， KHIJNIAK T V， TOUROVA T P， et al. Heterotrophic denitrification at extremely high salt and pH by haloalkaliphilic gammaproteobacteria from hypersaline sod alakes [J]. Extremophiles，2008，12：619-625.

[9] GLASS C，SILVERSTEIN J. Denitrification of high-nitrate， high-salinity wastewater [J].Wat Res，1999，33（1）：223-229.

[10] LI R P ， ZI，X L，WANG X F，et al. Marinobacter hydrocarbonoclasticus NY-4，a novel denitrifying， moderately halophilic marine bacterium [J]. SpringerPlus， 2013， 2：346-354.

[11] YOSHIE S， MAKINO H， HIROSAWA H， et al. Molecular analysis of halophilic bacterial community for high-rate denitrification of saline industrial wastewater[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，72（1）：182-189.

[12] 张培玉，郭艳丽，于德爽，等.一株轻度嗜盐反硝化细菌的分离鉴定和反硝化特性初探[J].微生物学通报，2009，36（4）：581-586.