张惠丹，汪薇，2*，白卫东，2，何洛强

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225；2.广东省岭南特色食品工程技术研究中心，广东广州510225；3.广东铭康香精香料有限公司，广东广州510000）

复合酶水解奶油制备天然奶味香基的工艺研究

张惠丹1，汪薇1，2*，白卫东1，2，何洛强3

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州510225；2.广东省岭南特色食品工程技术研究中心，广东广州510225；3.广东铭康香精香料有限公司，广东广州510000）

采用脂肪酶和蛋白酶组成的复合酶制剂作为催化剂，酶解奶油制备天然奶味香基。结果表明，当酶解温度为40℃，酶解时间7 h，奶油浓度为95%，酶添加量为1.0%，乳清液添加量为25%，脂肪酶A与复合蛋白酶比例为2∶1时，所制得的天然奶味香基为甜奶香型，其香气自然、柔和、圆润，此时所产奶味香基的酸价在18～21 mg/g之间，感官评分值可达到70以上。

天然奶味香基；奶油；脂肪酶；复合蛋白酶；酸价

奶味香精是食品工业中应用最为广泛的香精之一，主要用于糖果、饮料、冷食、焙烤食品等的增香，还可用于饲料的加香，改善饲料的适口性[1-5]。奶味香精对食品风味起着举足轻重的作用，添加合适的香精，其香气、口味将会有意想不到的改善，可以给食品原料赋香，矫正食品中的不良气味，也可以补充食品中原有香气的不足，稳定和辅助食品中的固有香气。

酶法制备奶味香基是指以稀奶油、牛奶等为主要原料，通过脂肪酶的作用将脂肪酸（饱和与不饱和的）、甘油三脂、酮酸和羟酸的甘油三酯酶解成饱和及不饱和脂肪酸、酮酸和羟酸，形成多种风味成分的前体物质，经过自然的氧化、断裂、内酯化等反应产生一系列风味物质。脂肪酸中偶数碳的香气贡献较大，羟酸进一步脱水环化生成不同碳数的丙、丁位内酯，尤其是偶数碳丁位内酯，其含量虽少，香气贡献却很大[6-7]。因此以奶油为原料，通过脂肪酶水解作用得到的酶解奶油，再以酶解奶油为基料加以适当修饰，即可得到天然奶味香精[8-14]。本文采用脂肪酶和蛋白酶组成的复合酶制剂作为催化剂，酶解奶油制备甜奶香型天然奶味香基，为天然奶味香基的工业化生产提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶油：市售；蛋白乳清粉：广州市日锋畜牧有限公司；脂肪酶A（lipase A）来源于黑曲霉（Aspergillus niger）、脂肪酶AY（lipase AY）来源于新筛选的皱摺假丝酵母（Candida rugosa）、脂肪酶G（lipase G）来源于青霉（Penicillium camemberti）、脂肪酶R（lipase R）来源于青霉（Penicillum roqueforti）：阿玛诺天野酶制剂商贸（上海）有限公司；复合蛋白酶：广东汇香源生物科技有限公司。乙醚、无水乙醇、KOH、酚酞等均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

THC-C恒温振荡器：太仓市试验设备厂；JJ500精密电子天平：上海精胜科学仪器有限公司；HH数显恒温水浴锅：金坛市金成国胜试验仪器厂；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱：广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乳清液的配制

称取一定量的乳清粉，再用乳清粉质量3倍的水溶解，混合均匀待用。

1.3.2 酶解工艺流程及操作要点

酶解工艺流程如下：

称取奶油→添加水和乳清液→85℃巴氏灭菌5 min→降温至30～45℃→添加脂肪酶和复合蛋白酶→于设定温度（35～45℃）下水解一定时间→85℃灭酶30 min→酸价测定→香气评分

操作要点：将无水奶油溶解之后，与适量乳清液按一定比例加入具塞三角瓶中搅拌均匀，于85℃进行预杀菌。降温至30～45℃之后，加入脂肪酶和复合蛋白酶，置于恒温振荡器中在180 r/min的条件下进行酶解，反应一段时间后，将三角瓶置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min）。酶解过后对产生的香气进行香气评分，并取其上清液测定酸价。

1.3.3 脂肪酶的筛选

在4个50 mL具塞三角瓶中分别加入12 g奶油，添加水至15 g，然后分别添加奶油质量的1%的不同的脂肪酶（lipase A、lipase G、lipase R、lipase AY），置于恒温气浴振荡器中开始反应（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min），灭酶过后对产生的香气进行感官评价，并取其上清液测定酸价。

1.3.4 不同因素对酶解奶油产香的影响

（1）温度对酶解奶油产香的影响

在5个50 mL具塞三角瓶中分别加入12 g奶油，添加水至15 g，然后分别添加奶油质量的1%的酶量（脂肪酶与复合蛋白酶比例为2∶1），置于不同温度的恒温气浴振荡器中开始反应，温度设置为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，转速180 r/min，酶解4 h后置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min），灭酶过后对产生的香气进行感官评价，并取其上清液测定酸价。

（2）奶油浓度对酶解奶油产香的影响

在6个50mL具塞三角瓶中分别加入7.5g、12.0g、13.5 g、14.3 g、14.7 g、15.0 g的奶油，添加水至15 g，所配制得奶油质量分数分别为50%、80%、90%、95%、98%和100%。然后分别添加为奶油质量的1%的酶量（脂肪酶与复合蛋白酶比例为2∶1），置于恒温气浴振荡器中开始反应（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min），灭酶过后对产生的香气进行感官评价，并取其上清液测定酸价。

（3）辅助底物对酶解奶油产香的影响

在2个50 mL具塞三角瓶中分别加入14.3 g奶油，添加水至15 g，分别添加乳清液与脱脂奶粉3.6 g，然后各添加奶油质量1%的酶量（脂肪酶与复合蛋白酶比例为2∶1），置于恒温气浴振荡器中开始反应（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min），灭酶过后对产生的香气进行感官评价，并取其上清液测定酸价。

（4）乳清液添加量对酶解奶油产香的影响

在6个50 mL具塞三角瓶中分别加入奶油14.3 g，水0.7 g，乳清液1.2 g、1.4 g、2.4 g、3.6 g、5.0 g、7.1 g，即乳清液添加量分别为8.4%、9.8%、16.8%、25%、35%、50%，然后各添加奶油质量1%的酶量（脂肪酶与复合蛋白酶比例为2∶1），置于恒温气浴振荡器中开始反应（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min），灭酶过后对产生的香气进行感官评价，并取其上清液测定酸价。

（5）总酶量对酶解奶油产香的影响

在6个50 mL具塞三角瓶中分别加入奶油14.3 g、水0.7g、乳清液3.6 g，然后分别添加为奶油质量的0.5%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%的酶量（脂肪酶与复合蛋白酶比例为2∶1），置于恒温气浴振荡器中开始反应（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min），灭酶过后对产生的香气进行感官评价，并取其上清液测定酸价。

（6）脂肪酶和复合蛋白酶比例对酶解奶油产香的影响

在6个50 mL具塞三角瓶中分别加入奶油14.3 g、水0.7 g、乳清液3.6 g，总酶量为奶油的1%（脂肪酶与复合蛋白酶比例分别为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1），置于恒温气浴振荡器中开始反应（40℃、180 r/min），酶解4 h后置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min），灭酶过后对产生的香气进行感官评价，并取其上清液测定酸价。

（7）酶解时间对酶解奶油产香的影响

在6个50 mL具塞三角瓶中分别加入奶油14.3 g、水0.7 g、乳清液3.6 g、然后各添加奶油质量1%的酶量（脂肪酶与复合蛋白酶比例为2∶1），置于恒温气浴振荡器中开始反应（40℃、180 r/min），分别酶解4 h、6 h、7 h、8 h、13 h后置于恒温水浴锅中开始灭酶（85℃、30 min），灭酶过后对产生的香气进行感官评价，并取其上清液测定酸价。

1.3.5 酸价测定

酸价（以脂肪计）测定方法参考GB/T 5530—2005《动植物油脂酸值和酸度测定》。

1.3.6 感官评价

由5位感官评价成员，根据各自的喜好对发酵所得奶味香精的香气进行香气强度、香气协调性、留香3个方面的评价，满分100分，具体的评分标准见表1。

2 结果与分析

2.1 脂肪酶的筛选

选择4种脂肪酶lipase A、lipase G、lipase R、lipase AY水解奶油制备天然奶味香基。lipase A主要作用于α位。lipase AY水解甘油三酯的1、2和3位置形成短链、中链和长链脂肪酸。lipase G主要作用于甘油单酯、甘油二酯，游离出脂肪酸。lipase R主要作用于甘油三酯的α位。除长链外，更能游离出中链、短链脂肪酸。

不同微生物来源的脂肪酶由于酶活中心结构的差异，水解相同的甘油三酯所表现出的脂肪酸特异性不同。奶味香气主要是由低级脂肪酸、羰基化合物以及极微量的挥发性成分组成。中短链脂肪酸对奶味香气直接贡献较大，是构成奶香的直接因素[15]。另外，酶活性越强，酶解就越充分，所得风味物质就越丰富，不同脂肪酶对酶解奶油产香的影响见表2。由表2可知，lipase A活力较其他三个大，且酶解奶油产生的香型是甜香型。选择lipase A为催化剂，酶解奶油制备甜香型天然奶味香基。

2.2 温度对酶解奶油产香的影响

酶类对温度比较敏感，温度过高会使脂肪酶变性失活；温度过低会抑制酶的活性，同时也会影响底物的黏度，从而影响传质速度。温度对酶解奶油产香的影响结果见表3。

由表3可知，当温度低于40℃时，随着温度的升高，酸价和香气评分呈现上升的趋势，随着酶活性的增强，香气浓度也随之增加；当温度高于40℃时，随着温度的增加，令人不悦的酸臭味加重，奶香变淡。综合考虑，最适的酶解温度选择40℃为宜。

2.3 奶油含量对酶解奶油产香的影响

适量的水能促进酶反应，而过量的水会使酶反应速度下降，导致酶解奶油产香效果变差。奶油含量越大，酶解产生的风味物质就越多越丰富，但当奶油含量过大时，就可能产生一些不需要的风味物质，使得所产奶味香基香气不协调，带有异味（如酸味）等。奶油含量对酶解奶油产香的影响见表4。

由表4可知，当奶油含量＜95%时，奶油含量越高，香气强度越大，且酸价也有上升的趋势；当奶油含量达到95%时，所得奶味香基为浓郁、圆润，回味悠长的香甜型奶味，此时测得所产奶味香基的酸价为18.7 mg/g；当奶油浓度＞95%时，产香效果开始变差，所得奶味香基均带有酸味，酸价仍然呈上升趋势。综合考虑，最适的奶油含量选择95%为宜。

2.4 辅助底物对酶解奶油产香的影响

以纯奶油为底物水解后产物的香气较为单一，通过添加辅助底物可以使产物的香气更加丰富。不同辅助底物水解产物的香气评分如表5。

由表5可知，辅助底物为乳清液的香气最为柔和纯正，产品的风格丰富。因此，选用乳清液为辅助底物。

2.5 乳清液添加量对酶解奶油产香的影响

乳清液的添加使得酶解底物更加丰富、柔和，具有修饰奶味香基风味的作用，并且使所得奶味香基的口感更加细腻香滑。乳清液添加量对酶解奶油产香的影响见表6。

由表6可知，当乳清液添加量＜3.6 g时，随着乳清液添加量的增加，感官评价的分数也越高；当乳清液添加量达到3.6 g时，所得奶味香基为浓郁、圆润，回味悠长的香甜型奶味，此时测得所产奶味香基酸价为19.2 mg/g；当乳清液添加量＞3.6 g时，随着乳清液含量的增加，产香效果越差，焦糖味加重，所得奶味香基的酸价也随之呈上升趋势。综合考虑，最适的乳清液添加量选择3.6 g即25%为宜。

2.6 总酶量对酶解奶油产香的影响

酶催化生成奶味香基时，其用量对香基的风味有较大影响。酶用量少时，风味物质生成量少，奶味较淡；用量过多，虽然可以产生大量的风味物质，但会引起其它不良现象的产生，如产生异味等，再者也会增加生产成本。酶添加量对酶解奶油产香影响的结果见表7。

由表7可知，当总酶量＜1.0%时，随着总酶量的增大，产香效果越好，香气越浓郁，上清液颜色越深且清澈；当总酶量为1.0%时，所得奶味香基为浓郁、圆润且回味悠长的香甜型奶味，此时测得所产奶味香基酸价为19.7 mg/g；当总酶量＞1.0%时，所得奶味香基开始出现酸败味，且随着总酶量的增大，酸败味越严重，酸价亦呈上升趋势。综合考虑，最适的总酶量选择1.0%为宜。

2.7 脂肪酶和复合蛋白酶比例对酶解奶油产香的影响

随着脂肪酶比例的增加，酶解奶油产生的风味底物就越多越丰富，原来的清淡奶香味变成浓郁香醇的奶香味。复合蛋白酶可同时对多种蛋白质进行水解，使酶解后产生的奶味香基风味得到修饰，口感更加细腻香滑。脂肪酶和复合蛋白酶比例对酶解奶油产香的影响结果见表8。

由表8可知，当脂肪酶A与复合蛋白酶比例＜2∶1时，随着脂肪酶A添加量的增大，所得奶味香基的香气强度也随之加强，酸价呈上升趋势；当脂肪酶A与复合蛋白酶比例为2∶1时，所得奶味香基的香气最浓郁，奶香味与甜味协调，自然且留香时间久，此时测得所产奶味香基的酸价为20.6 mg/g；当脂肪酶A与复合蛋白酶比例＜2∶1时，随着脂肪酶A添加量的增大，所得奶味香基的风味就越不协调，且酸败味加重，酸价仍然呈上升趋势。综合考虑，最适的脂肪酶A与复合蛋白酶比例为2∶1。

2.8 酶解时间对酶解奶油产香的影响

从理论上说，酶解时间越长，酶解就越彻底，实际上，过长的反应时间可能会造成不良风味物质的生成增多，影响香基的整体风味，但如果作用时间过短，使得反应程度不足，风味物质生成太少，风味没有充分形成，所以要达到理想的风味，反应时间应控制好。酶解时间对酶解奶油产香的影响结果（表9）可知，当酶解时间＜7 h时，酶解时间越长，所得奶味香基的香气就越浓郁，酸价随之呈上升趋势；当酶解时间为7 h时，产香效果达到最好，所得奶味香基呈现出浓郁、圆润的奶香气，并与奶甜味协调，留香时间长，此时测得所产奶味香基的酸价为21.0 mg/g；酶解时间＞7 h时，开始出现酸败味，且随着酶解时间的加长，酸败味也随之加重，酸价呈上升趋势。综合考虑，最适的酶解时间选择7 h为宜。

3 结论

复合酶制备天然奶味香基的最适脂肪酶为lipase A，最适酶解温度为40℃，最适奶油浓度为95%，最适辅助底物为乳清液，最适乳清液添加量为25%，最适总酶量为1.0%，最适脂肪酶与复合蛋白酶比例为2∶1，最适酶解时间为7 h。在该最佳反应条件下，所产生的奶香风味香甜、浓郁、圆润、柔和，此时所产奶味香基的酸价在18～21 mg/g之间，感官评分值可达到70以上。

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ZHANG Huidan1,WANG Wei1,2*,BAI Weidong1,2,HE Luoqiang3
(1.Light Industry Institute of Food,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China; 2.Guangdong Engineering Technology Research Center for Lingnan Specialty Food,Guangzhou 510225,China; 3.Guangdong Wincom Flavors&Fragrances Co.,Ltd.,Guangzhou 510000,China)

The natural milky flavor was prepared from cream hydrolyzed by compound enzyme of lipase and protease.Results showed that the optimal reaction temperature,time,cream concentration,compound enzyme addition,whey solution addition,lipase A and protease ratio were 40℃,7 h, 95%,1.0%,25%,2∶1,respectively.The flavor of the prepared natural milky flavor was sweet milky.The acid value was between 18-21 mg/g and the sensory evaluation score of the milky flavor reached over 70.

natural milky flavor;cream;lipase;compound protease;acid value

TS202.3

A

0254-5071（2015）04-0141-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.032

2015-03-20

仲恺农业工程学院——广东铭康香精香料有限公司横向课题（D1141433）

张惠丹（1991-），女，本科生，研究方向为食品生物技术。

*通讯作者：汪薇（1981-），女，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。