王方方，杜风光，刘钺，徐灵鹤，姜超，张鹏飞

（河南天冠企业集团有限公司，河南南阳473000）

吸附菌体的霉菌筛选试验

王方方，杜风光，刘钺，徐灵鹤，姜超，张鹏飞

（河南天冠企业集团有限公司，河南南阳473000）

探索出一种新的吸附发酵液中菌体的方法。以曲霉菌作为试验菌株对异养小球藻发酵液进行吸附试验，通过霉菌筛选试验找出一株吸附效果良好的黑曲霉，并得出最佳的吸附条件为发酵液初始糖含量3.0 g/100 mL，小球藻初始质量浓度10.0 g/L，在此条件下接种后24～72 h霉菌的吸附能力最强，发酵液的质量浓度下降38.69%，吸光度值下降32.34%。通过酵母菌发酵液试验黑曲霉的吸附效果得到进一步验证。

黑曲霉；吸附；小球藻；酵母菌

生物发酵的最终目标是获取目的产物，大部分发酵过程的目的产物存在于发酵液中，首先要对发酵液固液分离，然后才能进行进一步的提取。但传统的固液分离方法存在诸多弊端[1]。

小球藻作为一种生物质能源的原料，具有生长速度快、生长周期短、油脂含量高（15%～80%）、对土地资源依赖小等诸多优势[2-3]，小球藻生物柴油没有迅速产业化的原因在于生产成本高[4]。由于小球藻个体微小（3～30 μm）、含水量＞90%，在小球藻生物柴油成本构成中，小球藻生物质收集成本占20%～30%[5]，对小球藻生物柴油产业应用影响较大。目前报道的小球藻的收集方法有筛网过滤法、离心固液分离法[6]、絮凝沉淀法[7-8]、气浮法[9-10]等，但是筛网过滤法仅适用于螺旋藻，絮凝沉淀法对于大面积培养操作困难，气浮法受天气影响较大，离心固液分离法能耗高，因此寻找一种绿色环保的收集工艺十分重要[11]。

霉菌是一些丝状真菌的统称，霉菌菌体由分枝或不分枝的菌丝构成[12]。菌丝粗大，直径约2～10 μm，比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍。霉菌带有的菌丝或菌丝体容易将接触到的物体包裹起来，形成大的细胞团，从而沉降下来，如霉菌可以吸附水体中重金属如Cd（II）、Cr（VI）、Pb2+等[13-15]。因此可以利用这种特性收集菌体，从而实现固液分离。

本试验利用黑曲霉、黄曲霉、亮白曲霉和灰绿曲霉开展发酵液中小球藻菌体细胞的收集工作，筛选出具有较好成团特性的霉菌，并对异养小球藻发酵液不同初始糖含量及不同初始质量浓度进行了试验，并通过酵母菌发酵液进行了试验验证，为小球藻的收集提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

酵母粉、蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、甘氨酸：天津科密欧化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.1.2 菌种

黑曲霉（As 3.388 2）、黄曲霉（As 3.395 0）、亮白曲霉（As 3.645 7）、灰绿曲霉（As 3.547）：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 培养基

小球藻培养基：磷酸一氢钾0.5g/L、磷酸二氢钾0.4g/L、硫酸镁0.2 g/L、甘氨酸0.1 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/L，pH值自然。

酵母菌培养基：将大米和大麦芽按1∶3的质量比混合，大米首先蒸熟，然后与大麦芽混匀后于60～65℃糖化4～6 h后过滤，调至所需浓度，pH值自然。

以上培养基均经过121℃、30 min灭菌后使用。

1.2 仪器与设备

SHP-80D生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；ZWY-211C恒温振荡培养器：上海智城有限公司；2100分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；Primo star显微镜：德国卡尔蔡司公司。

1.3 试验方法

1.3.1 霉菌的筛选

异养小球藻500 mL发酵液在摇床培养7 d，调整葡萄糖含量以及发酵液菌体质量浓度后分别接入4种霉菌，接入方式为斜面直接挑一环接入，接种后于摇床30℃、200r/min培养，培养期间观察发酵液中有无成团现象。发酵结束将效果好的霉菌发酵液静置4～6 h，取上清液，比较上清液的澄清度。

1.3.2 发酵液最适初始葡萄糖含量试验

取50 L发酵罐中的成熟小球藻发酵液，取5 mL发酵液检测葡萄糖含量，通过补加烘干过的固体葡萄糖调整发酵液的初始糖含量，将发酵液中葡萄糖含量分别调整至0.25 g/100 mL、0.8 g/100 mL、2.0 g/100 mL、3.0 g/100 mL、4.0g/100mL，每个梯度做3个平行样，每瓶装液量为500mL，斜面挑取一环霉菌接入，接种后于摇床30℃、200 r/min培养，发酵结束后发酵液用一次性纱布单层过滤，对滤液的吸光度值、菌体质量浓度、葡萄糖含量等参数进行检测。

1.3.3 小球藻发酵液最适初始质量浓度试验

取50L发酵罐中的成熟小球藻发酵液，取10mL发酵液测定菌体质量浓度，通过补加无菌水的方式将发酵液中小球藻质量浓度分别调整至2.0g/L、10.0g/L、18.0g/L、36.0g/L，每个梯度做3个平行样，每瓶装液量为500 mL，斜面挑取一环霉菌接入，接种后于摇床30℃、200 r/min培养，发酵结束发酵液用一次性纱布单层过滤，对滤液的吸光度值、菌体质量浓度、葡萄糖含量等参数进行检测。

1.3.4 小球藻发酵液接入霉菌的最佳培养时间试验

为了考察霉菌接入小球藻发酵液的最佳培养时间，将初始糖含量为3.0g/100mL，小球藻初始质量浓度为10.0g/L的发酵液中接入霉菌，跟踪记录每24 h的发酵液滤质量浓度和吸光度值。

1.3.5 测定方法[16]

（1）发酵液中小球藻含量测定

将发酵液摇匀后，用10 mL移液管精确吸取发酵液10 mL，完全放入离心管中，3 000 r/min条件下离心10 min，弃上清，沉淀用蒸馏水充分摇匀后再次离心，然后将上清液弃去，沉淀用少量蒸馏水洗至平皿中，105℃干燥箱内干燥4 h称质量，发酵液中小球藻含量的计算公式为：

式中：M1为干燥状态的空平皿称质量，g；M2为沉淀物于105℃干燥箱内干燥4 h，称得平皿与菌体的质量，g。

（2）糖含量测定

发酵液中可利用的糖为葡萄糖，葡萄糖的测定通过高效液相色谱法进行。发酵液3 000 r/min离心后取上清液进行测定。分离柱为AminexHPX-87H（300 mm×7.8 mm），流动相为0.003 mol/L稀硫酸溶液，流速为0.5 mL/min，葡萄糖保留时间为10.34 min，进样量5 μL，柱温65℃。糖含量变化量应为发酵后的糖含量与发酵前糖含量之差除以发酵前的糖含量。

（3）吸光度值测定

以发酵液离心后的上清液作为参比液，将上清液和发酵液各稀释相同的倍数，在波长540 nm处于分光光度计中测定其吸光度值。吸光度值变化量应为发酵后的吸光度值与发酵前吸光度值之差除以发酵前的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 霉菌初筛

将保藏的4株霉菌黑曲霉（As 3.388 2），黄曲霉（As 3.395 0），亮白曲霉（As 3.645 7），灰绿曲霉（As 3.547），分别挑取1环接入培养7 d的小球藻发酵液中，并于摇床上继续振荡培养，培养条件为30℃、200 r/min，培养结果见图1。在培养过程中发现，接入黑曲霉和黄曲霉的发酵液中出现明显的成团现象。

2.2 霉菌的进一步优选

对霉菌初筛试验中具有明显成团现象的黑曲霉和黄曲霉进行对比试验。异养小球藻发酵液中初始葡萄糖含量分别为0.2 g/100 mL、0.7 g/100 mL和2.0 g/100 mL。培养5 d后发酵液经静置后取上清液，其中2～4号试管初始葡萄糖含量为0.7 g/100 mL，5～8号试管初始葡萄糖含量为2.0 g/100 mL，9、10号试管初始葡萄糖含量为0.2 g/100 mL。2、5、6、10号试管接入霉菌为黑曲霉，3、4、7、8、9号试管接入霉菌为黄曲霉，上清液对比情况见图2。

从图2可知，无论发酵液初始糖含量高低，接种黑曲霉的2、5、6、10号试管的澄清度明显高于接种黄曲霉的3、4、7、8、9号试管。根据以上试验结果，可以初步断定黑曲霉对发酵液中小球藻的吸附效果优于黄曲霉。

2.3 发酵液最适初始葡萄糖含量试验

通过将小球藻发酵液初始糖含量调至不同的梯度进行试验，发酵96 h，将发酵液过滤后检测滤液的吸光度值、菌体质量浓度及葡萄糖含量，结果见表1。

从表1可以看出，随着发酵液中初始糖含量的增加，菌体质量浓度和吸光度值的变化幅度基本呈逐渐增加的趋势，但是当初始糖含量＞3.0 g/100 mL以后，菌体质量浓度增加缓慢，吸光度值已不再增加，因此确定发酵液的最适初始含糖量为3.0 g/100 mL。

2.4 小球藻发酵液最适初始质量浓度试验

将黑曲霉接入不同初始质量浓度的小球藻发酵液中，以确定最优的发酵液初始浓度，初始葡萄糖含量为3.0 g/100 mL。发酵结束对滤液吸光度值、菌体质量浓度进行检测，结果见表2。

从表2可以看出，菌体初始质量浓度太低时，霉菌对小球藻的吸附成团效果不理想，但是质量浓度并非越高越好。因为随着菌体初始质量浓度的增加，小球藻的生长优势会超过霉菌，发酵液出现质量浓度和吸光度值增加的现象，说明发酵液中的营养物质被小球藻利用。因此发酵液中小球藻的初始质量浓度以10.0 g/L为宜。

2.5 小球藻发酵液接入霉菌的最佳培养时间试验

为了考察霉菌接入小球藻发酵液的最佳培养时间，将初始糖含量为3.0 g/100 mL，初始质量浓度为10.0 g/L的小球藻发酵液中接入黑曲霉，跟踪记录每天的发酵液菌体质量浓度和吸光度值，结果见图3。

由图3可以看出，在霉菌刚接入发酵液后，菌体质量浓度和吸光度值略有增加，说明小球藻含量略有上升；在培养24 h后，随着霉菌的不断生长，发酵液中出现成团现象，小球藻质量浓度和吸光度值明显下降；在72 h之后，下降速度趋于平缓。说明霉菌聚集小球藻成团的最佳时间是在接种后的24～72 h。从发酵初始至72 h，小球藻质量浓度由10.26 g/L降至6.29 g/L，降幅为38.69%；吸光度值（发酵液稀释50倍测定）由0.575降至0.389，降幅为32.34%。

2.6 霉菌吸附小球藻镜检结果

培养过程中霉菌吸附小球藻镜检结果见图4。

由图4可以看出，黄曲霉通过菌丝对小球藻的包裹产生吸附作用，黑曲霉良好吸附效果主要是由于其含有大量的菌丝及菌丝体，在菌丝的生长过程中对发酵液中的小球藻产生环绕、牵绊，使藻体吸附于菌丝间。可知黑曲霉培养96 h包裹小球藻的效果好。

2.7 霉菌对酵母菌的成团效果

将黄曲霉和黑曲霉接入含有酵母菌的成熟培养液中，摇瓶培养，定时取样，测定酵母菌的质量浓度值，结果见表3。

由表3可以看出，接种霉菌后，滤液中酵母菌质量浓度均下降，但是接种黑曲霉48h后菌体的滤液质量浓度低于接种黄曲霉48h后的质量浓度，即霉菌对酵母菌也有一定的吸附效果，且黑曲霉对酵母菌的吸附成团效果优于黄曲霉。

3 结论

将4株霉菌黑曲霉（As 3.388 2），黄曲霉（As 3.395 0），亮白曲霉（As 3.645 7），灰绿曲霉（As 3.547）接入小球藻发酵液中，黑曲霉和黄曲霉对小球藻具有明显的成团现象；将黑曲霉和黄曲霉接入不同初始糖含量的小球藻发酵液中，在消耗相当量的葡萄糖的情况下，黑曲霉的吸附效果优于黄曲霉。

对黑曲霉接入小球藻发酵液的初始糖含量和初始质量浓度进行了考察，发现在发酵液的初始糖含量为3.0 g/100 mL、初始质量浓度为10.0 g/L的条件下，黑曲霉对小球藻的吸附效果最佳。黑曲霉在小球藻发酵液的生长过程中，其最佳吸附时间是在接种后24～72 h，其具有良好吸附效果的原因是霉菌本身有大量的菌丝和菌丝体。与初始接种相比，小球藻质量浓度下降38.69%，吸光度值下降32.34%。

对酵母菌发酵液进行试验，黑曲霉对酵母菌的吸附效果也优于黄曲霉，其对酵母菌的吸附成团效果不及小球藻，其可能原因是酵母菌发酵液中含有的乙醇对霉菌的生长有一定的抑制作用。

[1]俞俊棠，唐孝宣，邬行彦，等.新编生物工艺学（下册）[M].北京：化学工业出版社出版，2003.

[2]CHISTI Y.Biodiesel from microalgae[J].Biotechnol Adv,2007,25 (3):294-306.

[3]SPOLAORE P,JOANNIS-CASSAN C,DURAN E,et al.Commercial applications of microalgae[J].J Biosci Bioeng,2006,101(2):87-96.

[4]CHISTI Y.Biodiesel from microalgae beats bioethanol[J].Trends Biotechnol,2008,26(3):126-131.

[5]TREDICI M R.Mass production of microalgae:photobioreactors[M]// Handbook of microalgal culture:Biotechnology and applied phycology. Hoboken:Wileg-Blackwell,2004.

[6]徐跃定，冯伟民，唐玉邦，等.小球藻规模化生产收集技术[J].江苏农业科学，2009（6）：319-320.

[7]韦金河，汪廷，冯伟民，等.小球藻大面积养殖技术[J].江苏农业科学，2004（2）：74-76.

[8]李东玲.小球藻的培养管理[J].特种经济动植物，2006（2）：39.

[9]郑必胜，张国权，蔡妙颠，等.利用气浮法收集小球藻的生物量[J].海湖盐与化工，1999，28（6）：8-11.

[10]周全.制盐母液养殖盐藻及气浮收集技术的研究[J].海湖盐与化工，1995，24（6）：11-16.

[11]林喆，匡亚莉，郭进，等.小球藻收集技术的进展与展望[J].过程工程学报，2009，9（6）：1242-1248.

[12]肖君，甄玉国，王晓磊.米曲霉不同培养饭是的发酵探究[J].中国酿造，2014，33（7）：48-50.

[13]刘桂萍，刘长风，关丽杰，等.霉菌菌丝球对Pb2+的吸附研究[J].沈阳化工学院学报，2005，19（2）：93-96.

[14]王国惠.霉菌菌丝球对Cr（VI）的吸附特性[J].中山大学学报：自然科学版，2007，46（3）：112-116.

[15]张玉玲，张兰英，刘娜，等.霉菌吸附水体中Cr（VI），Cd（II）离子研究[J].环境科学与技术，2006，29（1）：21-22.

[16]沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2000.

WANG Fangfang,DU Fengguang,LIU Yue,XU Linghe,JIANG Chao,ZHANG Pengfei
(Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China)

A novel method for adsorbing thallus in fermentation broth was explored.UsingAspergillussp.as test strains,experiments were carried out in heterotrophic chlorella fermentation broth to screen the optimal strain for chlorella adsorption.Results showed thatA.nigerhad good adsorption effect,and the optimal adsorption condition was initial glucose content 3.0 g/100 ml in fermentation broth,initial chlorella concentration 10.0 g/L. The strongest adsorption capacity was obtained during 24-72 h after inoculation.Under this condition,the concentration of the broth reduced 38.69%, while the absorbance reduced 32.34%.The absorption effect ofA.nigerwas further verified by yeast fermentation experiment.

Aspergillus niger;adsorption;chlorella;yeast

X703

A

0254-5071（2015）04-0114-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.026

2015-03-12

科技支撑计划项目（2011BAD14B00）

王方方（1983-），女，硕士，主要从事菌种的保藏与筛选工作。