洪建芬，陆月平，张翔珍

(浙江省乐清市第二人民医院妇产科，浙江 乐清 325608)

iNKT细胞在自发性早产发动机制中的作用研究

洪建芬，陆月平，张翔珍

(浙江省乐清市第二人民医院妇产科，浙江 乐清 325608)

目的 探讨恒定型自然杀伤T细胞(iNKT)在自发性早产发动中的作用。方法 选择自发性早产孕妇40例(早产组)和正常孕妇40例(对照组)。采用流式细胞术检测蜕膜组织中iNKT细胞和自然杀伤(NK)细胞的表达；采用RT-PCR法检测穿孔素(perforin)mRNA的表达。结果 早产组蜕膜组织中iNKT细胞和NK细胞的百分比分别为(1.05±0.29)%和(24.21±9.32)%，均显著高于对照组iNKT细胞(0.48±0.17)%和NK细胞(14.97±6.05)%的百分比(t值分别为2.267和2.094，均P<0.05)；经Spearman秩相关分析显示，早产组iNKT细胞和NK细胞呈明显的正相关(r=0.634，P<0.05)；RT-PCR结果显示，早产组穿孔素mRNA的表达也显著高于对照组(t=2.086，P<0.05)。结论 iNKT细胞可能通过产生穿孔素并促进NK细胞活化，参与自发性早产的免疫发病机制。

恒定型自然杀伤T细胞；自发性早产；免疫；作用机制

早产是常见的孕中晚期并发症，其发生率占妊娠的5%～15%[1]。早产的病因和发病机制目前尚不清楚，以往的研究发现宫内感染、子宫病理性扩张、宫颈口松弛、蜕膜出血以及各种妊娠激素水平异常等因素均可参与早产的发生。近年来，越来越多的研究者认识到免疫系统的激活，特别是固有免疫的活化在早产发生中占有重要地位[2-3]。恒定型自然杀伤T细胞(invariant natural killer T-cells，iNKT)是一类存在于人类与小鼠蜕膜组织中重要的固有免疫细胞，可通过活化自然杀伤(NK)细胞，产生穿孔素(perforin)及其他免疫因子，发挥清除母-胎界面病原体的功能。2006年Boyson研究小组发现，iNKT细胞参与了早产的发病，但机理尚未明确。本研究主要通过检测早产孕妇体内iNKT细胞水平的变化，及下游免疫细胞NK细胞和穿孔素的变化，以探讨iNKT细胞在早产发病中的免疫学作用，为临床预防或早期诊断早产提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2012年6月至2014年6月在乐清市第二人民医院产科经阴道分娩的早产患者40例(胎膜早破23例，无胎膜早破17例)设为早产组，孕龄为30～36+6周，早产组孕妇入组标准：①无宫内感染及合并绒毛膜羊膜炎；②无下生殖道或泌尿道感染；③未合并前置胎盘及胎盘早剥；④无其他明确可引致早产的因素。另随机选择同期在本院正常经阴道分娩的足月孕妇40例设为对照组，孕龄为37～41周。两组孕妇均为初产妇，均为单胎、头位，孕期血糖、血压正常，无妊娠合并症及内外科并发症，无免疫性疾病，无免疫性药物治疗史。早产组和对照组孕妇的平均年龄分别为(26.3±4.1)岁和(25.8±3.5)岁，两组差异无统计学意义(t=1.245，P=0.271)。

1.2 标本的采集和单细胞悬液的制备

取两组孕妇经阴道娩出胎盘约1.0cm×1.0cm×1.0cm的蜕膜组织块，冰生理盐水洗净血迹。剪取少部分组织予OCT(聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物)包埋，液氮速冻，置-80℃存放，用于后续RT-PCR检测。其余组织剪碎并经50μm孔径的尼龙网过滤后，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，加磷酸盐缓冲液(PBS)离心洗涤后，以1×106/mL的浓度重悬细胞，送流式细胞检验。

1.3 流式细胞术

将调整好浓度的细胞悬液置于流式管内，将荧光抗体PerCP-CD3、FITC-NK1.1、APC-CD56和PE-CD16(BD，美国)对细胞进行常规染色，4℃避光20min，洗去游离抗体后，100μL重悬，在流式细胞仪(LSR-Ⅱ，美国Beckman)下检测并计数CD3+NK1.1+的NKT细胞和CD16+CD56+的NK细胞。

1.4 逆转录PCR

取50～75mg冻存的蜕膜组织置于研钵内，以研棒将组织碾碎；严格按照RNA提取试剂盒(GIAGEN，德国)说明书的要求提取总RNA。一步法RT-PCR：反应总体系为50μL，其中组织总RNA 2μL，10×PCR Buffer 5μL，50mmol/L MgSO41.5μL，10mmol/L dNTP 1μL，穿孔素和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上下游引物各0.5μL，莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水补足50μL。反应条件：42℃ 30min，95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环。反应结束后，取扩增产物5μL在1.0%琼脂糖凝胶中于120V下进行电泳检测，并采用Biocapt凝胶成像系统对结果进行分析。穿孔素上游引物：5'-ATC TCA CCT CAT GGG AAC C-3'；穿孔素下游引物：5'-CCA TTA ACG ACC TGC TGT TC-3'；GAPDH上游引物：5'-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT G-3'；GAPDH下游引物：5'-TCC TTG GAG GCC ATG TAG G-3'。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两组恒定型自然杀伤T细胞和自然杀伤细胞比较

流式细胞术检测结果显示，早产组孕妇蜕膜中iNKT细胞和NK细胞均显著高于对照组的正常妊娠孕妇，经比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表1。对早产组iNKT细胞和NK细胞行Spearman秩相关分析显示，iNKT细胞和NK细胞呈明显的正相关，其相关系数r=0.634，P<0.05。

2.2 两组穿孔素的比较

经RT-PCR检测结果显示，早产组孕妇蜕膜中穿孔素mRNA的(穿孔素/GAPDH)表达为9.537，明显高于对照组正常孕妇的5.989，t=2.086，P<0.05，见图1。

图1 两组穿孔素mRNA表达比较结果

Fig.1 Comparison of perforin mRNA expression between two groups

3 讨论

3.1 早产与免疫

胎儿在母体子宫内作为一种半同种异体移植物存在，妊娠期间胎儿不被母体免疫系统排斥的重要原因是母体免疫耐受的作用。母胎免疫耐受的实质是母体免疫细胞对胎盘滋养细胞呈低或无反应性，这种耐受一旦被打破，则可能诱发早产的发动。部分自发性早产与宫内感染、炎症反应等密切相关，但也有部分自发性早产在临床无明显感染征象，在这些早产孕妇体内，免疫系统的异常激活及功能紊乱在早产的发病机理中起着重要的作用。固有免疫细胞对早产的影响是21世纪以来较新的发现，而关于iNKT细胞是目前多数研究的焦点。

3.2 恒定型自然杀伤T细胞与免疫

NKT细胞最早由Fowlker等于1987年在小鼠体内发现，之后于20世纪90年代末在人类免疫系统中发现[4]。NKT细胞来源于胸腺，在体内多种器官、组织中均有分布，如：肝脏、骨髓、脾、脐血等。该细胞亚群同时具有传统T细胞和NK细胞的某些表型特征，其细胞表面既表达T细胞抗原受体(TCR)又表达NK1.1[5]。iNKT细胞被认为是经典的NKT细胞，可识别由类似于I型主要组织相容性复合体(MHC-I)糖蛋白CDld提呈的鞘糖酯类抗原，发挥增强免疫反应或抑制免疫反应的双向免疫调节功能，在抗肿瘤、抗感染、器官移植的抗排斥以及控制自身免疫性疾病的发展中起重要作用[6]。

3.3 恒定型自然杀伤T细胞与妊娠

iNKT细胞在妊娠的母体中也具有双向免疫功能，其表现为iNKT细胞可以通过清除母-胎界面的病原体而起到维持妊娠的作用，但其在清除病原体时，活化的iNKT细胞又可通过直接产生穿孔素或间接活化NK细胞，影响内分泌及免疫系统而导致流产或早产[7]。有研究显示，妊娠早期的母体内iNKT细胞比例升高，诱导Th细胞分泌多种细胞因子，促进血栓素酶的活化并作用于胎盘的滋养细胞，导致凝血而阻断母胎血供；同时还可活化和吸引中性粒细胞攻击胚胎和胎盘组织，引发流产[8]。Li等[9]发现，在小鼠动物模型中去除iNKT细胞后，其早产现象显著降低。另有研究发现，妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)孕妇较正常妊娠妇女蜕膜iNKT细胞和NK细胞明显增多；子痫前期孕妇外周血中NKT细胞比例及穿孔素表达增加[10]。本研究则发现，在早产孕妇蜕膜组织中，iNKT细胞和NK细胞的百分比、穿孔素mRNA均较正常妊娠孕妇明显增加；而前述已有研究[7]证实iNKT细胞可以通过表达穿孔素直接杀伤细胞，也可通过活化NK细胞影响妊娠妇女的内分泌系统。因此认为iNKT细胞是妊娠中的关键物质，在早产孕妇体内iNKT细胞数量的异常增加可能是导致早产发病的重要免疫因素；而iNKT细胞参与早产的发生是通过产生穿孔素和活化下游NK细胞来实现的。

总之，iNKT细胞是维持妊娠的一把双刃剑，这类细胞在引起自发性早产的免疫机制中占有重要的地位，值得引起研究者及临床医生高度重视。

[1]乐杰.妇产科学.[M].7版.北京:人民卫生出版社,2008:93-96.

[2]Gomez-Lopez N, StLouis D, Lehr M A,etal.Immune cells in term and preterm labor[J].Cell Mol Immunol,2014,11(6):571-581.

[3]Christian L M.Psychoneuroimmunology in pregnancy:Immune pathways linking stress with maternal health, adverse birth outcomes, and fetal development[J].Neurosci Biobehav Rev,2012,36(1):350-361.

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[5]Monteiro M, Graca L.iNKT cells: innate lymphocytes with a diverse response[J].Crit Rev Immunol,2014,34(1):81-90.

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[7]陈敏琦,张建平.自发性早产的免疫发病机制[J].现代妇产科进展,2009,18(12):942-943.

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[专业责任编辑：韩 蓁]

Role of iNKT cells in the launch of spontaneous preterm labor

HONG Jian-fen, LU Yue-ping, ZHANG Xiang-zhen

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,SecondPeople’sHospitalofLeqing,ZhejiangLeqing325608,China)

Objective To investigate the role of invariant natural killer T-cells (iNKT) cells in the launch of spontaneous preterm labor. Methods Totally 40 preterm pregnant women (preterm group) and 40 normal pregnant women (control group) were selected. Flow cytometry was used to detect iNKT cells and NK cells in decidual tissue, and RT-PCR was used to detect the expression of perforin mRNA. Results The percentages of iNKT cells and NK cells in decidual tissue in the preterm group were (1.05±0.29)% and (24.21±9.32)%, respectively, which were significantly higher than those of iNKT cells (0.48±0.17)% and NK cells (14.97±6.05)% in the control group (tvalue was 2.267 and 2.094, respectively, bothP<0.05). Spearman rank correlation analysis showed that iNKT cells was positively related with NK cells in the preterm group (r=0.634,P<0.05). RT-PCR results revealed that the expression of perforin mRNA in the preterm group was significantly higher than that in the control group (t=2.086,P<0.05). Conclusion INKT cells may take part in the immune pathogenesis of spontaneous preterm labor through the production of perforin and the promotion of NK cell activation.

invariant natural killer T-cells (iNKT)；spontaneous preterm；immune；action mechanism

2015-01-06

洪建芬(1981-)，女，主治医师，主要从事妇产科临床工作。

张翔珍，副主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.05.004

R714.21

A

1673-5293(2015)05-0920-02