易 辉，李 燕

（成都中医药大学医学技术学院，四川成都611130）

表皮葡萄球菌生物膜形成中细胞间多糖黏附素的调控机制研究进展

易 辉，李 燕＊

（成都中医药大学医学技术学院，四川成都611130）

近年来由于医疗植入物如导管、人工心瓣膜、人工关节等的广泛应用以及人口老龄化及免疫力低下人群的出现等因素，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）导致的生物膜相关性疾病逐年上升，至今尚无药物能有效地控制这类感染。细菌生物膜的形成是一个多基因调控、多因子参与的延续性过程，包括初始黏附、聚集、成熟、脱落四个阶段，而细胞间多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）是存在于细菌细胞表面的多糖黏附因子，在SE生物膜形成过程中的细菌聚集阶段发挥十分重要作用。因此，深入研究SE生物膜形成中PIA的调控机制对治疗SE引起的生物膜感染意义重大。

1 PIA在生物膜形成中的作用

PIA是存在于细菌细胞表面长达130个糖基的β－1，6－2－脱氧－2－氨基－D－吡喃葡萄糖糖链，其中大于80%的残基去乙酰化。PIA不仅能介导细菌间黏附形成生物膜，而且参与细菌感染宿主的过程，如保护细菌抵抗宿主β防御素3、IL－37等抗菌肽天然免疫组分的识别清除等。同时PIA也是SE生物膜基质中对抗人体免疫系统的第一道防线，是SE逃逸免疫攻击和毒力所必需的［1］。

2 ica操纵子控制PIA合成

PIA主要是由ica基因编码的酶蛋白催化合成的［2］。ica操纵子包含四个功能基因icaA、icaD、icaB、icaC和一个调节基因icaR。icaA编码的IcaA是一种跨膜的N－乙酰氨基葡糖转移酶，与IcaD的结合可显著增强其酶活性，合成最长不超过20个残基的N－乙酰葡糖胺低聚物，在IcaC的作用下，低聚物才能组成更长的链状多聚物，而且IcaC很可能涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞的表面，IcaB负责脱去N－乙酰葡糖胺多聚物中的乙酰基使其能够附着到细菌细胞表面介导生物膜的形成。IcaR属于四环素阻遏蛋白家族，位于icaADBC操纵子的上游区域，能表达出转录抑制蛋白，其核心作用在于高效地负调节icaADBC操纵子的转录，减少PIA的形成［3］。

3 多种因子调控ica基因表达从而调控PIA合成

ica基因的表达受到许多因子的调控，包括双组份信号转导系统、密度信号感应系统、全局调控因子（Sar蛋白家族、SigB、Spx等）等。在不同种属间ica的调控机制不同，即使在同一种属不同菌株间ica的调控机制也不同，特别值得注意的是在不同实验条件下诱导形成的生物膜及其ica表达是不完全相同的。例如，许多研究是在体外使用标准96微孔板分析生物膜的形成，其中有些研究者使用的是未经处理的平板，而有些研究者是在平板中添加血清使得生物膜形成的环境更接近于人体内［4］。这些不同的实验条件造成了各个实验结果之间比较的复杂性。并且，目前对于SE中ica调控机制的研究结果几乎都是基于体外模型或者动物模型，这都不能完全反应人体内生物膜感染的实际情况。尽管存在这些缺陷，这些研究结果还是显示了生物膜形成中ica表达的重要性。

3.1 双组份信号转导系统调控ica基因的表达

双组分信号转导系统是在原核生物界广泛存在且保守的一类系统，不仅参与调控细菌基本生命活动和很多重要的生理功能，并且与很多病原菌的毒力和致病性（尤其是细菌生物膜形成）密切相关，一般包括一个作为感受器的组氨酸蛋白激酶和一个作为效应器的调节蛋白。当外界信号作用于组氨酸蛋白激酶的膜外配体结合区时，激活激酶的ATP结合位点，从而结合、水解ATP为ADP，并将ATP的磷酸基团转移到激酶HisKA功能域的组氨酸位点，使其发生自身磷酸化。随后反应调节蛋白调控区域能够与磷酸化的组氨酸蛋白激酶相互作用，将激酶上的磷酸基团转移到自身天冬氨酸位点上，发生自身磷酸化并激活效应区，使其构象改变而暴露DNA结合位点，结合其靶DNA序列，从而产生一系列调控反应。

目前发现在SE中存在16－17对双组份信号转导系统，包括ArlSR、SrrAB、SaeSR等。刘敬然等［5］通过构建ArlR的原核表达质粒，并以纯化ArlR作为抗原免疫小鼠，获得相应的多克隆抗体，然后采用蛋白免疫印迹法检测SEl457野生株在生长期不同时间点ArlR的表达水平，结果显示在SE生物膜形成细菌聚集阶段ArlR蛋白的表达和arlR的转录水平均达到高峰，提示ArlRS可能通过调控ica的表达而影响PIA的合成。Yang等［6］用同源重组法构建了ArlRS缺失突变株，发现缺失株不能形成生物膜，并通过基因芯片和实时定量PCR检测证明缺失株中icaADBC的表达水平明显降低，而在缺失株中过表达icaADBC可以恢复其生物膜形成能力。最后通过凝胶迁移阻滞实验发现ArlR可以与ica操纵子的启动子区结合，表明ArlRS可以直接上调ica操纵子的转录促进PIA合成。武勇聪等［7］采用温度敏感性质粒pMAD敲除了SE1457srrA基因，发现srrA突变株与野生株相比，在有氧条件下生长明显滞后，PIA合成减少，生物膜形成能力降低，对常用抗生素的敏感性无改变。然后利用激光共聚焦显微镜观察到srrA突变株形成的生物膜较野生株薄，srrA回复株生长及生物膜形成能力均与野生株类似。最后采用qRT－PCR对影响生物膜形成的主要基因进行转录谱分析，发现srrA突变株中icaR上调、icaA下调，参与呼吸代谢的多个基因均下调，这说明srrAB可以通过下调icaR的表达而上调icaA的表达促进PIA合成。Qiang等［8］利用同源重组法构建了saeSR删除株，并对其生物学表型进行了研究。生物膜半定量检测法显示saeSR删除株生物膜形成能力明显高于野生株，并发现saeSR可能是调控生物膜形成中的细菌聚集阶段影响生物膜形成的，同时saeSR删除株中生物膜PIA含量明显高于野生株。但在后续saeSR删除株基因与蛋白表达谱分析中，并没有发现ica操纵子表达水平的变化。

3.2 密度信号感应系统调控ica基因的表达

密度信号感应系统是指细菌细胞密度依赖的细胞间信号机制，可以协调细菌特定基因的表达，可调节毒力、二次代谢物的产生、细菌生物膜的形成以及细菌的存活，有利于细菌适应环境压力。目前，在SE中最重要的两个密度信号感应系统是辅助基因调节系统（accessory gene regulator，agr）和luxS系统，但是，在SE中尚未发现agr系统可直接通过调控ica基因的表达而控制PIA的合成，与其相反的是，luxS基因可有效负调控ica操纵子的转录，显著影响PIA的产量，从而抑制生物膜的形成。

luxS系统在环境变化时可以通过改变细菌细胞密度而影响细胞间信号转导，从而控制多种基因表达，它是细菌硫代谢中参与甲基循环的代谢酶之一，可催化合成AI－2，AI－2是信号分子，广泛存在于大多数细菌中［9］。Xu等［10］通过构建luxS删除株，发现删除株比野生株的生物膜形成能力大大增强，并且icaC的转录增加超过4倍，PIA的合成量增加3倍。而且在luxS基因回补株中或者是在删除株中添加外源性的AI－2信号分子，ica的表达与PIA的合成量可以恢复至野生株水平。在中央静脉插管感染模型中，删除株比野生株表现出更大的毒力与致病性，这主要是因为删除株中PIA合成明显增多所致，这说明LuxS可以负调控ica的转录从而减少PIA合成，抑制生物膜形成。

3.3 全局调控因子调控ica基因的表达

SE生物膜形成中的全局调控因子包括Sar蛋白家族、SigB、Spx等。

3.3.1 Sar蛋白家族 目前在SE中的Sar蛋白家族主要有SarA、SarX、SarZ等。sarA基因表达的SarA蛋白是一种二聚DNA结合蛋白，拥有4个α螺旋的中心结构和1个β折叠的结构。在SE中，SarA调控ica的表达，其对PIA的合成是必须的，SarA突变株不能形成生物膜［11］。Tormo等［12］构建了SE sarA删除株，发现无论是在静止状态还是流动状态下，sarA删除株都不能形成生物膜。RT－PCR证实在sarA突变株中，icaADBC的表达明显降低，而icaR的表达无明显变化。阻滞凝胶电泳发现SarA与icaA的启动子序列有很高的亲和力，可以与之结合促进ica的表达。SarX是一个新发现的全局调控因子，Row等［13］证实在SE CSF41498中SarX可以结合到同源agr启动子上抑制agr的转录，促进生物膜形成。在随后的研究中Row等还发现SE CSF41498中SarX不仅可以与其agr P3启动子结合促进生物膜形成，而且可以直接与ica启动子结合以ica依赖的方式促进生物膜形成。然而RT－PCR结果却显示无论是sarX突变株还是sarX的过表达都能激活agr RNAⅢ的转录，所以这很难说明sarX对agr的调控作用。与之相反的是，RT－PCR和免疫印迹分析显示了在sarX突变株中，icaA的转录和PIA的合成明显下降，在sarX过表达株中，icaA的转录和PIA的合成明显增多。SarZ与SE生物膜的毒力表达密切相关，Wang等［14］利用高通量的分子筛检测sarZ对生物膜形成相关基因的调控作用，发现在SE1457株中，sarZ可以通过调控ica基因的表达而控制PIA的合成。

3.3.2 SigB SE的sigB操纵子由rsbU，rsbV，rsbW和sigB四个基因组成，对sigB基因的调控是由复杂的信号转导通路控制，在此通路中RsbU，RsbV，RsbW在环境压力下被激活，随后调控sigB，其中RsbU和RsbV对sigB具有正调控作用，RsbW对sigB起负调控作用，这与枯草杆菌和金黄色葡萄球菌中sigB的调控作用具有同源性。无论是在体外还是体内，SigB对SE生物膜的形成意义重大［15］。Knobloch等［16］发现在SE sigB突变株中，icaADBC不能正常表达，生物膜不能合成，并且在SE1457株和SE8400株中，RsbU的失活可以导致icaADBC的转录下降，因此认为在某些环境压力下（如高盐），SE可以通过RsbU启动sigB基因，减低icaR的表达，促进icaADBC的表达，促进PIA合成与生物膜形成。但是目前，无论是SE中还是金黄色葡萄球菌中，都没有在ica操纵子中找到SigB的结合位点，提示sigB对ica的调控是间接的［17］。

3.3.3 ClpP与Spx SE基因组编码的Clp蛋白酶（Clp proteases，ClpP）是一类ATP依赖的蛋白酶，具有糜蛋白酶活性，在切割蛋白过程中需要ATP的水解，而Spx为ClpP的酶活底物，它们在细菌应对环境压力时发挥作用。Wang等［18］发现在SE中，clpP基因的失活可导致其在小鼠模型中生物膜相关感染能力减弱，与野生株相比，clpP敲除株的附着能力下降了16倍，PIA的合成也明显减少。在他们的后续研究中［19］，又发现SE clpP基因敲除突变株中Spx蛋白显著蓄积，并且在spx突变株中icaR的转录明显下降而icaADBC的转录明显上升，这提示Spx蛋白能够抑制细菌的黏附聚集，并通过正调控icaR的表达而抑制icaADBC操纵子的转录，抑制生物膜形成。由于Spx为ClpP的酶活底物，我们可以推测ClpP调控SE生物膜形成的功能是通过特异性降解Spx实现的。

3.4 ygs调控ica基因的表达

Ygs是近来发现的一个新的调控SE生物膜形成的因子，它可以影响SE生物膜形成的聚集阶段和对环境压力的抵抗，在生物膜相关感染中对生物膜的结构和生理功能发挥重要作用。Wang等［20］利用转座子对临床分离的生物膜阳性SE1457株构建了随机插入突变库，通过生物膜半定量的方法筛查了大约1000个菌株，发现12个菌株的生物膜形成明显缺陷，这12个菌株插入到11个不同的基因中，ygs是其中一个基因。随后又对ygs突变株与野生株进行比较分析，发现突变株的生物膜形成明显缺陷且在生物膜形成的第二阶段PIA的合成量也明显减少，通过回复突变发现其生物膜形成能力能回复到野生株的水平，说明ygs是一个影响生物膜形成的新基因。实验组又通过定量PCR方法进一步检测了ica的表达水平，发现在对数期野生株中icaB的表达水平是突变株的9倍，而icaR在突变株的表达水平是野生株的2－3倍，这说明ygs可以通过抑制icaR的表达来促进icaADBC的转录，从而促进PIA的合成与生物膜的形成。另外，在各种压力下，包括热，高pH，高盐，乙醇等条件都可以使突变株的生长明显比野生株要慢，这些都说明ygs基因参与了多种应激条件的反应，且通过控制PIA的产量来影响生物膜的形成。而且，ygs基因在大鼠中央静脉插管感染模型和小鼠皮下置管感染模型的致病性方面都发挥着重要的致病作用。

3.5 真核类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（serine／threonine protein kinase，stk）调控ica基因的表达

细菌Stk是一类依赖ATP的蛋白激酶，能把ATP上的γ－磷酸转移到蛋白质分子的丝氨酸、苏氨酸残基上，既可以磷酸化其他的蛋白质，也可催化自身磷酸化反应。结构分析发现Stk蛋白有两个功能域，即蛋白激酶功能域和PASTA重复序列区功能域。STK激酶功能域主要参与对底物蛋白的磷酸化修饰，PASTA重复序列功能域可能与细胞壁的代谢有关。Liu等［21］利用同源重组构建stk突变株，采用生物膜半定量法检测生物膜形成，发现stk突变株生物膜的形成能力显著下降。随后将stk基因全长以及各功能域克隆到质粒上，转化入stk突变株获得互补株，发现stk基因全长互补株和具有蛋白激酶功能域的互补株其生物膜表型回复，而具有PASTA重复序列功能域的互补株对生物膜的形成则没有作用。最后利用RT－PCR检测生物膜相关基因的转录水平，发现stk是通过促进ica操纵子的表达而增加PIA的合成，从而促进生物膜形成。利用小鼠插管局部感染模型发现stk突变株感染小鼠后其在感染组织中的细菌数量明显低于野生株，引起的炎症反应也明显减弱。所以，stk在SE生物膜形成以及致病过程中都起着重要作用，stk的蛋白激酶功能域可以上调ica操纵子的表达，从而促进PIA合成及生物膜形成。

3.6 环境因子调控ica基因的表达

许多研究表明向培养基中添加额外的葡萄糖、乙醇、氯化钠，都会增加葡萄球菌生物膜中PIA的合成，并且这一调控是发生在icaADBC转录之后［22］。Vuong等［23］发现在许多相同环境下，如高渗透压（高糖、高盐等）、高温、乙醇等，都会诱导PIA的合成，并且这些条件都能抑制三羧酸循环，所以Vuong等提出这些条件诱导PIA的合成是通过三羧酸循环这个中间物调控ica的表达实现的。acnA编码的顺乌头酸酶是参与三羧酸循环中的一个重要的物质。Sadykov等［24］发现在SE1457acnA突变株中，三羧酸循环被阻断，而icaADBC的表达明显增加，这说明高渗透压、高温、乙醇等环境因素可能是通过抑制三羧酸循环从而促进icaADBC的表达，促进PIA合成与生物膜形成。还有一些抗生素（如四环素、庆大霉素等）的亚抑菌浓度也可以增强ica操纵子的转录，促进PIA合成与生物膜形成［25－26］。

4 结语

在SE生物膜形成过程中PIA起着非常重要的作用。PIA的合成主要受ica操纵子的调控，然而许多因子都调节着ica的表达，所以PIA的调控机制非常复杂。同时生物膜的形成也不仅仅是依赖于PIA途径，许多研究还发现存在独立于PIA以外的蛋白依赖途径，如Aap、Bhp、Embp途径［27］。目前已发现大约有90%的SE携带aap基因，其表达产物Aap与生物膜形成密切相关。在无PIA合成的情况下，虽然仅有15%－45%的SE表达Bhp，但是Bhp也可以诱导SE细菌聚集及生物膜的形成。而Embp是一种能与细胞外基质结合的大蛋白，可与纤连蛋白结合引起细胞间黏附从而使细菌形成生物膜。由此可见，SE生物膜的形成是一个复杂的过程，具有多种调控机制，需要更广泛、更深入研究才能阐明。

［1］Rohde H，Frankenberger S，Zahringer U，et al.Structure，function and contribution of polysaccharide intercellular adhesin（PIA）to Staphylococcus epidermidis biofilm formation and pathogenesis of biomaterial－associated infections［J］.Eur J Cell Biol，2010，89（1）：103.

［2］Fey PD，Olson ME.Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis［J］.Future Microbiol，2010，5（6）：917－933.Paul

［3］Jeng WY，Ko TP，Liu CI，et al.Crystal structure of IcaR，a re－pressor of the TetR family implicated in biofilm formation in Staphylococcus epidermidis［J］.Nucleic Acids Res，2008，36（5）：1567－77.

［4］Cue D，Lei MG，Lee CY.Genetic regulation of the intercellular adhesion locus in Staphylococci［J］.Front Cell Infect Microbiol，2012，26（2）：38.

［5］刘敬然，孙志平，许 涛，等.ArlR反应调节蛋白在表皮葡萄球菌不同生长期表达的检测［J］.微生物与感染，2009，4（2）：92.

［6］Wu Y，Wang J，Xu T，et al.The two－component signal transduction system ArlRS regulates Staphylococcus epidermidis biofilm formation in an ica－dependent manner［J］.PLoS One，2012，7（7）：e40041.

［7］武有聪，许 涛，刘华勇，等.葡萄球菌呼吸相关双组分系统SrrAB研究进展［J］.微生物学通报，2012，39（12）：1796.

［8］Lou Q，Zhu T，Hu J，et al.Role of the SaeRS two－component regulatory system in Staphylococcus epidermidis autolysis and biofilm formation［J］.BMC Microbiology，2011，11：146.

［9］Hardie KR，HeurIier K.Establishing bacterial communities by word of mouth：luxS and autoinducer 2in biofilm development［J］.Nat Rev Microbiol，2008，6（8）：635.

［10］Xu L，Li H，Vuong C，et al.Role of the luxS quorum－sensing system in biofilm formation and virulence of Staphylococcus epidermidis［J］.Infect Immun，2006，74（1）：488.

［11］Handke LD，Slater SR，Conlon KM，et al.σB and SarA independently regulate polysaccharide intercellular adhesin production in Staphylococcus epidermidis［J］.Can J Microbiol，2007，53（1）：82.

［12］Tormo MA，MartíM，Valle J，et al.SarA is an essential positive regulator of Staphylococcus epidermidis biofilm development［J］.J Bacteriol，2005，187（7）：2348.

［13］Rowe SE，Mahon V，Smith SG，et al.A novel role for SarX in Staphylococcus epidermidis biofilm regulation［J］.Microbiology，2011，157：1042.

［14］Wang L，Li M，Dong D，et al.SarZ is a key regulator of biofilm formation and virulence in Staphylococcus epidermidis［J］.J Infect Dis，2008，197（9）：1254.

［15］Pintens V，Massonet C，Merckx R，et al.The role of sigmaB in persistence of Staphylococcus epidermidis foreign bodyinfection［J］.Microbiology，2008，154：2827.

［16］Knobloch JK，Jager S，Horstkotte MA，et al.RsbU－dependent regulation of Staphylococcus epidermidis biofilm formation is mediated via the alternativeσfactorσB by repression of the negative regulator gene icaR［J］.Infect Immun，2004，72（7）：3838.

［17］Cotter JJ，O’Gara，et al.Oxygen－mediated regulation of biofilm development is controlled by the alternative sigma factor sigma（B）in Staphylococcus epidermidis［J］.Environ Microbiol，2009，75：261.

［18］Wang C，Li M，Dong D，et al.Role of ClpP in biofilm formation and virulence of Staphylococcus epidermidis［J］.Microbes Infect，2007，9（11）：1376.

［19］Wang C，Fan J，Niu，et al.Role of spx in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis［J］.FEMS Immunol Med Microbi－ol，2010，59：152.

［20］Wang X，Niu C，Sun G，et al.ygs is a novel gene that influences biofilm formation and the general stress response of Staphylococcus epidermidis［J］.Infect Immun，2011，79：1007.

［21］Liu Q，Fan J，Niu C，et al.The eukaryotic－type serine／threonine protein kinase stk is required for biofilm formation and virulence in Staphylococcus epidermidis［J］.PLoS One，2011，6（9）：e25380.

［22］Boles BR，andHorswill，et al.Staphylococcal biofilm disassembly［J］.Trends Microbiol，2011，19：449.

［23］Vuong C，Kidder JB，Jacobson，et al.Staphylococcus epidermidis poly－saccharide intercellular adhesin production significantly increases during tricarboxylic acid cycle stress［J］.J Bacteriol，2005，187：2967.

［24］Sadykov MR，Olson，et al.Tricarboxylic acid cycle－dependent regulation of Staphylococcus epidermidis polysaccharide intercellular adhesion synthesis［J］.J Bacteriol，2008，190：7621.

［25］Cue D，Lei MG，Lee CY.Activation of sarX by Rbf is required for biofilm formation and icaADBC expression in Staphylococcus aureus［J］.J Bacteriol，2013，195（7）：1515.

［26］Stewart EJ，Satorius AE，Younger JG，et al.Role of environmental and antibiotic stress on Staphylococcus epidermidis biofilm microstructure［J］.Langmuir，2013，29（23）：7017.

［27］Mekni MA，Bouchami O，Achour W，et al.Strong biofilm production but not adhesion virulence factors can discriminate between invasive and commensal Staphylococcus epidermidis strains［J］.APMIS，2012，120（8）：605.

易辉（1991－），女，四川成都人，研究生在读，主要从事细菌耐药分子机制研究。

2015－03－04）

1007－4287（2015）09－1598－05

基因项目：四川省教育厅自然科学重点课题（10ZA084）

＊通讯作者