李素霞, 张 秀, 李 杨, 张 斌, 史宪伟, 余选富, 刘学洪*

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南省腾冲县畜牧工作站，云南 腾冲 679100)

科学试验

FST基因多态性与槟榔江水牛和德宏水牛繁殖性能的相关性研究

李素霞1, 张 秀1, 李 杨1, 张 斌1, 史宪伟1, 余选富2, 刘学洪1*

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南省腾冲县畜牧工作站，云南 腾冲 679100)

[目的]为了解水牛繁殖性能的分子基础及建立检测分子标记,本研究分析卵泡抑素(FST)基因在槟榔江、德宏水牛中的多态性，并与繁殖性能进行关联分析。[方法]研究采用PCR扩增及DNA测序方法，检测水牛FST基因多态性，并分析该基因变异位点与繁殖性能的关系。[结果]在槟榔江、德宏水牛的FST基因序列共检测到7个SNP位点，未发现插入/缺失变异。经χ2检验，除德宏水牛中SNP6偏离Hardy-Weinberg遗传平衡状态，其他SNP位点均处于Hardy-Weinberg遗传平衡状态。FST基因与槟榔、德宏水牛产犊和产犊率性状相关不显著，而当两个群体合并后，FST基因有两个变异位点与产犊率呈极显著相关。[结论]FST基因在槟榔江、德宏水牛中存在较高基因变异性，FST基因与水牛繁殖性状的关系还需进一步研究。

水牛；FST；多态性；繁殖性状；关联性

槟榔江水牛是迄今为止我国唯一的河流型水牛[1]，具有较高的产奶性能，德宏水牛属于沼泽型水牛，具有较好的产肉性能[2]，两者都是发展云南特色畜牧业的宝贵种质资源。然而，槟榔江水牛群体整齐度较差，个体间生产性能差异较大，数选育程度较低的水牛类型[3]。德宏水牛虽净肉率高、肉质好，但存栏量已呈下降趋势，并出现严重的品种退化现象[4]。

因此，繁殖力是影响其保种的重要因素之一，也是影响水牛业生产效率的重要因素之一。

卵泡抑素(Follistatin,FST)是一种广泛存在的单链糖蛋白，在卵母细胞成熟过程中起重要作用[5]。目前尚无该基因与水牛产犊年龄、产犊率及繁殖性能相关性的报道。本研究以槟榔江、德宏水牛为试验动物，对槟榔江及德宏水牛FST基因多态性进行了研究，分析不同基因型与繁殖性能的关系，旨在寻找槟榔江水牛及德宏水牛与繁殖性能有关的标记位点，为槟榔江水牛及德宏水牛选育、种质资源的保护及有效利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验在云南省腾冲县巴福乐槟榔江水牛良种发育有限公司采集了81头槟榔江水牛样品，在德宏州盈江县采集了56头德宏水牛样品。采样时详细记录槟榔江水牛和德宏水牛的毛色、母牛产犊年龄、产犊间隔、产犊数、产犊成活数、配种次数等生长发育及繁殖性状相关资料。

血液样品4℃低温运送至实验室，-20℃保存备用。耳组织样品浸泡于无水乙醇中于-20℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用传统的苯酚/氯仿和蛋白酶K标准法提法水牛基因组DNA,TE缓冲液溶解，-20℃保存备用。

1.2.2 引物合成 根据NCBI上提供牛(Bostaurus)的FST全基因组序列(Gene bank登录号：NC-007318.5)利用primer3在线设计引物并由上海生工生物工程公司合成。引物序列、PCR产物大小及扩增区域见表1；PCR体系与条件见文献[1]。

1.2.3 测序 PCR扩增产物送上海立菲生物技术有限公司进行双向测序，测序采用ABI3730xl测序仪及配套的BigDye Terminator试剂盒。

1.2.4 序列分析 采用Bioedit软件查看测序质量，利用DNAStar软件包中的SeqMan对所测序列进行自动排序，用SeqAlign程序对校对后的序列进行自动排序，确定FST基因变异位点的碱基、数量及位置。

1.3 统计分析

等位基因频率、基因型频率、χ2Hardy-Weinberg平衡检验的计算方法见参考文献[6]。

关于繁殖性状分析，本研究利用奶牛场DHI生产记录的水牛产犊数、产犊年龄、平均产犊间隔数据，根据最小二乘法建立下列模型：$$Yijk=μ+Gi+Ej+Lk+eijk$$ 式中Yijk为第i个个体表型的记录值；μ为群体平均值；Gi为第i个个体的基因效应值；Ej为产犊强度效应；Lk胎次的固定效应；eijk为随机误差。根据以上线性模型，利用SAS9.0对繁殖性能数据进行分析。产犊率=产犊数/母牛实际年龄。

2 结果与分析

2.1 FST基因PCR扩增结果

利用本研究设计的水牛FST引物PCR扩增槟榔江水牛和德宏水牛，扩增产物条带清晰，产物片段大小与预期片段大小相符，特异性良好，可用于测序反应。电泳检测结果见图1。

2.2 基因序列分析

为了检测水牛FST基因多态性，本研究对特异性水牛基因组DNA扩增产物纯化测序。通过对所有测序结果进行分析，发现7个变异位点，所检测的所有变异位点均为单核苷酸变异，所有变异位点主要以转换、颠换为主，未发现碱基插入或缺失现象。其中外显子2产生1处G668T突变，氨基酸分析表明，此处突变导致223位氨基酸甘氨酸变成缬氨酸。检测到的所有SNP位点信息见表2。

注：E1(+112)表示SNP位点位于第1外显子最后一个碱基下游112 bp处；E2(-114)表示此SNP位点位于第2外显子第一碱基上游114 bp处；668/E2表示变异位点位于第2外显子，编码区668 bp处。以下同。

2.3 FST基因在槟榔江与德宏水牛中的基因频率与基因型频率

2.3.1 FST基因在槟榔江中的基因频率与基因型频率 本研究计算了FST基因7个SNP在槟榔江水牛群体中等位基因频率和基因频率。有5个SNP位点(1，2, 5, 6, 7)存在较高的变异频率，其最小等位基因频率高于0.05。所有7个SNP位点在槟榔江水牛均在于Hardy-Weinberg遗传平衡状态。FST基因7个SNP位点在槟榔江水牛群体中等位基因频率和基因型频率及哈代-温伯格遗传平衡计算结果见表3。

2.3.2 FST基因在德宏水牛中的基因频率与基因型频率 本研究计算了FST基因7个SNP在德宏水牛群体中等位基因频率和基因型频率。有6个SNP位点(1,2,3,5,6,7)存在较高的变异频率，其最小等位基因频率高于0.05。除SNP6外，其他6个SNP位点在德宏水牛均在于Hardy-Weinberg遗传平衡状态。FST基因7个SNP位点在德宏水牛群体中等位基因频率和基因型频率及哈代-温伯格遗传平衡计算结果见表4。

2.3.3 FST基因在2个水牛群体中的基因频率与基因型频率 本研究计算了FST基因7个SNP在槟榔江水牛和德宏水牛两个群体中等位基因频率和基因型频率。有5个SNP位点(1，2，3，4，5，7)存在较高的变异频率，其最小等位基因频率高于0.05。除SNP6外，其他6个SNP位点在德宏水牛均在于Hardy-Weinberg遗传平衡状态。FST基因7个SNP位点在槟榔江水牛和德宏水牛两个群体中等位基因频率和基因型频率及哈代-温伯格遗传平衡计算结果见表5。

2.4 FST基因与水牛繁殖性能的关系

运用SAS9.0数据分析软件，统计了FST基因7个变异位点不同基因型与水牛产犊年龄、产犊强度方差分析的显著性检验，统计分析分为槟榔江水牛群体、德宏水牛群体以及两个水牛合并群体的方差分析统计检测，具体结果见表6，表7与表8。

3 讨 论

FST在雌性动物中可以促进子宫内膜的生长、排卵、刺激多卵泡发育等[7]。王春强等人研究表明适宜FST浓度可显著提高牛受精卵的总卵裂率[8]。该基因在水牛上的研究不多，目前为止未见他人做过有关槟榔江水牛及德宏水牛FST基因的研究，因此无从比较。本实验通过对槟榔江水牛、德宏水牛FST基因序列进行比较，共检测到7个变异位点，其中共有1个外显子变异，此变异为引起氨基酸改变的功能性变异。变异分析表明，槟榔江水牛、德宏水牛具有很高的基因变异性，且DNA变异均为单碱基(SNP)变异,未发现插入/缺失变异。利用χ2检验检测水牛FST基因全部7个变异位点的哈代-温伯格遗传平衡，结果显示，除德宏水牛中SNP6偏离Hardy-Weinberg遗传平衡状态，其他SNP位点均处于Hardy-Weinberg遗传平衡状态。偏离Hardy-Weinberg遗传平衡状态的SNP是由于样本数量有限所致，还是与选种选育引起的遗传漂变有关有待于进一步研究。

当分别计算FST基因7个变异位点在槟榔江水牛群体、德宏水牛群体中与繁殖性能的相关性均不显著后，将两个群体合并，分析发现FST基因有两个变异位点(E2(-114)和668/E2)与繁殖强度呈极显著相关，p值分别为0.013，0.015。FST基因这两个位点与水牛繁殖性能在两个群体的互作关系还有待进一步研究。此次检测的7个变异位点与繁殖性能的关系为提高槟榔江水牛、德宏水牛的繁殖性能做了很好的铺垫，特别是与繁殖性能有相关性的变异位点可作为分子标记应用。

以上结果显示，FST基因可能是影响水牛繁殖性能的一个主要基因。然而，因为我们利用的是基因测序的方法，试验中检测的个体数有限，基因变异与繁殖性能的相关性还需要建立遗传标记检测方法在大群体中进一步验证。水牛FST基因高度多态性为探索基因功能与水牛繁殖性能奠定了基础。同时，本研究所检测的7个变异位点可以整合到槟榔江水牛、德宏水牛的选育方案中，为建立繁殖性能标记辅助选择提供科学依据。

4 结 论

本研究首次以FST基因为对象，对槟榔江水牛和德宏水牛的遗传多样性和繁殖性能关联进行了研究，结果发现FST基因多态性对水牛繁殖性状的影响达到了显著水平，因此,本研究认为FST基因可以作为水牛繁殖性能分子标记辅助选择的候选基因。

[1] 季 敏，余长林，余选富，等.槟榔江水牛STAT5A基因多态性及MspI PCR-RFLP遗传标记的建立[J].中国牛业科学，2012，38(6)：12-18.

[2] 宋敏艳，高文春，罗在仁，等.德宏水牛及杂交后代FSH-β基因多态性与繁殖性能的关系[J].中国牛业科学，2013，39(5)：26-32.

[3] 苗永旺，李大林，章纯熙.槟榔江水牛保种及选育利用策略[J].中国牛业科学，2012，38(1)：46-50.

[4] 尹正发，王维柱，陈德寿.德宏水牛的保种选育及利用[J].中国牛业科学，2010，36(2)：37-39.

[5] 田锦，李志敏，傅衍，等.抑制素、活化素和卵泡抑素研究进展[J].动物医学进展，2008，29(12)：77-81.

[6] 刘桂琼，姜勋平，丁家桐.梅山猪ob基因多态性与繁殖性状的相关性研究[J].中国畜牧杂志，2002，38(4)：15-16.

[7] 高立坤，葛仕豪，王树迎.济宁青山羊垂体促性腺激素的季节性变化[J].西南农业学报，2008，21(1)：180-182.

[8] 王春强，马 宁.卵泡抑素对牛卵母细胞体外成熟及早期胚胎生长发育的影响[J].中国畜牧杂志，2011，47(15)：23-25.

Association of FST Polymorphism and Reproduction Traits in Binglangjiang and Dehong Water Buffalo Breeds

LI Su-xia1, ZHANG Xiu1, LI Yang1,ZHANG Bin1, SHI Xian-wei1, YU Xuan-fu2, LIU Xue-hong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan650201,China; 2.AnimalHusbandryWorkStationofTengchongCounty,Tengchong,Yunnan679100,China)

【Objective】In order to understand molecular basis of reproduction and establish genetic markers in domestic water buffalo, FST gene polymorphism were investigated in Binglangjiang and Dehong water buffalos.【Method】Polymorphism of FST gene in Binglangjiang and Dehong buffalo were investigated by direct sequencing and PCR amplification, and association between SNPs and reproductive performance were analyzed. 【Result】Our results revealedthat total of 7SNPs were detected in FSTgenes. Except SNP6 in Dehong buffalo, all SNPs of FST gene in buffalo population were agreed with Hardy-Weinberg equilibrium by chi-square test.No associations were found between SNPs and reproduction traits, but two SNPs were highly significantly related to reproduction traits when the two groups combined. 【Conclusion】FST gene was of high polymorphism in both Binglangjiang and Dehong buffalo populations, so relationship with reproduction traits might be further investigated.

water buffalo;FSTgene;polymorphism; reproduction traits; association

2014-12-26 修改日期:2015-01-18

云南省现代农业奶牛产业技术体系(云财教2013年160#)

李素霞(1989-)，女，山东菏泽人，在读硕士研究生，主要从事动物遗传育种与繁殖方面的研究。

*通讯作者：刘学洪(1956-)，男，云南昭通市人，硕士生导师。

S8-1

A

1001-9111(2015)02-0017-06