沈建良，韩 颖，黄友章

造血干细胞低温保存与复温操作规程(讨论稿)

沈建良，韩 颖，黄友章

低温保存造血干细胞的效果受诸多因素的影响，如温度、降温速率、细胞含量、低温保护剂、解冻复温过程、保存时间以及检测指标，由于各研究中心之间所用方法存在一定差异，导致结果可比性差，循证力度较弱。因此至今为止，国内尚无相关操作指南，国外也只有欧洲的国际细胞治疗学会和血液及骨髓移植组联合认证委员会指南。作者结合自身多年血细胞低温保存工作经验和各种文献，起草了适用于医院小型低温保存库的操作规程，供同行参考，并期待大家批评指正。

造血干细胞；低温保存；复温

低温保存造血干细胞并应用于临床治疗已有数十年历史，证明安全、可行。但至今为止，各中心执行的操作方法差异较大，国外只有欧洲的国际细胞治疗学会和血液及骨髓移植组联合认证委员会指南，国内尚无统一的操作指南或标准。导致这种状况的原因是，在整个低温保存过程中，诸多因素影响保存效果，各研究中心之间所用方法有所差异，研究结果可比性较差，循证力度较弱。其主要表现在:①保存温度。20世纪80年代倾向于-196℃，90年代倾向于-80℃[1-9]。众多研究认为，-196～-80℃是低温保存的标准温度[10-12]。②降温速率。长期以来一直将程控降温作为标准，但大量的研究表明，非程控降温安全、简便，结果与程控降温可比[2，5-6，13-14]。不仅适用于来源于骨髓和外周血的干细胞[10，15]，也适用于脐血干细胞[16-17]。但也有研究表明，细胞活力上两者无差异，粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(colony-forming unit-granulocyte-macrophage，CFU-GM)检测结果不如程控降温方法[7]。③细胞含量。早期强调有核细胞含量不超过2×107/mL[4，18]。1994年Rowley等[19]发现，5.6×108/mL的细胞含量也能很好耐受。以后的其他研究也得出相似的结论[20]。目前推荐的细胞含量为2×108/mL[19]。④低温保护剂。1959年二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)首次被用作低温保护剂，此后一直被作为标准的低温保护剂，通常为10%[1-2，6]。然而，临床实践中发现，部分患者输注后出现恶心、呕吐、腹痛等不良反应[21]，还有患者出现心血管、呼吸、中枢神经系统及肾脏、肝脏、溶血毒性表现，甚至有死亡病例报道。后来的研究表明，2.2%～6.0%的DMSO也有效[2-3，5，22-24]，2.2%～6.0%DMSO联合细胞外保护剂羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)可以更有效地保存细胞[5-6，25]，也能明显降低＞6.0%DMSO带来的不良反应。进一步研究发现，丙烯乙二醇、维生素Eα、过氧化氢酶和抗坏血酸的联合物以及海藻糖均可作为细胞内和细胞外的保护剂[26-28]。⑤解冻(复温)。标准解冻方法是37℃水浴箱加温，使所有冰晶均消失为止[6]。但也有研究发现，在0、20、37℃下解冻20 min，结果无差异[29]。目前也有用干加热设备进行解冻的报道[30]。⑥洗涤。解冻后洗涤去除DMSO是标准做法[12，27]，现有的标准洗涤方法是纽约血液中心的2步稀释方案[12]。解冻后通过洗涤或稀释来降低DMSO的含量已得到广泛应用[21-22]。但也有研究报道，造血干细胞对 DMSO有抵抗性，不需洗涤[6]。国内大多数单位也未进行洗涤[31]，因为洗涤过程不可避免会损失部分干细胞[32]。⑦保存时间。低温保存干细胞的确切时间至今仍不清楚。低温保存早期，红系爆式集落形成单位(burst-forming unit-erythroid，BFU-E)、CFU-GM就有损伤，但总有核细胞和CD34+细胞以及在非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷病(non-obesity diabetes/severe combined immunedeficiency disease，NOD/SCID)小鼠中的植入能力可保持较长时间[1-2，5，7-8，25，33]，脐血干细胞也观察到类似现象[11，27，29，34]。用流式细胞术和克隆形成方法证实干细胞保存 12年甚至15年是可行的[35-36]，用NOD/SCID小鼠移植方法证实，冻存15年的脐血仍保持造血功能。海军总医院血液科保存25年的骨髓仍能扩增出正常的间充质干细胞[37]。在临床上保存7年的骨髓用于临床移植获得成功[17]，也有报道保存8年[33]、11年[4]、21年[38]后成功移植的病例。Galmes等[39]报道，-80℃下保存的造血干细胞，单个核细胞活力与CFU-GM、BFU-E的回收率进行性下降，至24个月时降至0，长期保存组移植后造血重建速度较短期保存组慢，因此不推荐在5% DMSO、-80℃下保存时间超过6个月。但也有研究表明，5%DMSO联合6%HES、-80℃保存5～18个月，仍有92%的有核细胞回收率和88%的细胞活力[40]。⑧细胞功能的检测。移植前检测低温保存的造血干细胞功能最有价值的方法是在NOD/SCID小鼠进行移植[41-42]，但在临床上该项目作为常规开展还有困难，目前仍以有核细胞形态、计数、台盼蓝拒染率、CD34+细胞计数、造血干细胞培养为主要检测方法[43]。

为了在今后对我国低温保存工作进行规范创造条件，作者结合自身多年血细胞低温保存工作经验和各种文献，起草了适用于医院小型低温保存库的操作规程，供同行参考，并期待大家批评指正。

1 原则

造血干细胞(包括骨髓血、外周血和脐带血来源)为有核细胞，对有核细胞的低温保存与复苏，基本原则是细胞中加入低温保护剂，缓慢降温、快速复温(慢冻快融)。低温保护剂多采用DMSO加白蛋白或DMSO加HES和白蛋白，这些物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。程控降温时降温速率要求:4～-30℃，1～2℃/min；-30～-80℃，3～10℃/ min；此后直接移入-196℃液氮中保存。非程控降温2步法:第1步，样本从4℃冰箱直接移入-80℃冰箱内(至少24 h、降温速率＜1.0℃/min)；第2步，至少24 h后，将样本从-80℃冰箱移入液氮中。若保存时间预计在6个月内，也可在-80℃冰箱中保存(不移入液氮中)；但若需长期保存(6个月以上)，则建议从-80℃冰箱移入-196℃液氮中长期保存。细胞复温应采用快速融化的方法(37～40℃水浴箱)，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

2 设备、器材与试剂

洁净工作台(千级)；

细胞培养仪器设备；

二甲基亚砜(分析纯，推荐英、美产品)；

人血白蛋白；

磷酸盐缓冲液(pH 7.25～7.35)；

低温离心机(4℃)；

电子秤(精确到0.01 g)；

血浆挤压器；

近年来，烟台市接连实施三年荒山绿化、三年水系绿化、森林城市美丽烟台建设等重点工程，林业生态建设迈出稳健步伐。今年1月，市政府召开会议，印发《国土绿化提升三年攻坚行动实施方案》，在全市启动实施国土绿化提升三年攻坚行动，明确至2020年，完成造林和生态修复32万亩、森林抚育60万亩，森林覆盖率达到38%。市林业局组织各县市区林业部门制定《国土绿化提升三年攻坚行动总体规划（2018-2020）》和年度计划，将任务分解落实到乡镇村庄。截至目前，全市完成造林11.68万亩、森林抚育20万亩，分别占省厅下达年度计划的124%和100%，推动森林资源总量和质量实现全面提升。

注射器推动器；

条码机；

高频热合仪；

冰箱(4℃)；

采血袋；

冰块冰冻袋；

低温保存袋(耐-196℃低温)；

低温保存样本盒(材质泡沫塑料，2 cm厚，用前置4℃冰箱)；

液氮保存夹；

防冻手套；

倒置相差显微镜；

超低温冰箱(-80℃)或程控降温仪；

液氮容器；

恒温水浴(35～40℃)振荡器。

3 无菌培养室的准备

使用前将无菌培养室内桌面、地面用消毒液擦拭；洁净工作台(千级)及无菌培养室用紫外线灯照射消毒30 min；洁净工作台内空气细菌培养结果应符合无菌标准。

4 造血干细胞低温保存方法

(1)低温保护剂配制:①DMSO-HES低温保护剂配制为DMSO 0.1 L、12%HES 0.5 L(用磷酸盐缓冲液配制)、20%人血白蛋白0.32 L、磷酸盐缓冲液0.18 L。②DMSO 0.2 L、20%人血白蛋白0.4 L、磷酸盐缓冲液0.40 L。

低温保护剂配方有多种，推荐使用第1种，临用前配制，置4℃冰箱待用。

(2)将收集的造血干细胞置4℃冰箱30 min。骨髓血和脐带血造血干细胞样本体积大，有核细胞含量也低；当体积＞100 mL，有核细胞低于10×109/L时，需对细胞体积和有核细胞进行适当浓聚。机器收集的外周血造血干细胞往往体积小，有核细胞含量高(如美国Bexter，CS3000-Plus血细胞分离机分离收集的外周血造血干细胞，体积常约为55 mL，有核细胞可达600×109/L)，则需要适当稀释。低温保存时最大有核细胞可为200×109/L。

骨髓血和脐带血浓聚:骨髓血体积常有800～1 200 mL，而脐带血体积常有150～200 mL。浓缩体积和细胞的方法是将骨髓血或脐带血样本注入采血袋，用热合器热合所有管道，放入4℃低温离心机中，400 g离心10 min，用血浆挤压器，去上清(浓缩体积，骨髓血至300 mL左右、脐带血至80 mL左右，1 mL约等于1 g)，置4℃冰箱待用。

(3)在洁净工作台内(室温＜25℃)，将等量低温保护剂缓慢加入造血干细胞悬液内，用热合器剪断所有管道。

加低温保护剂的方法有人工加样或自动加样(自动加样器)。

人工加样方法:①取出低温保护剂，将低温保护剂抽入注射器，并在注射器上连上头皮针，排出空气。②取出冰块冰冻袋，将其放在摇床上固定，移入洁净工作台内。③将装有造血干细胞的袋平放于冰块冰冻袋上，消毒造血干细胞袋的袋口边连接处，将上述连有低温保护剂的头皮针插入造血干细胞袋连接处，缓慢将低温保护剂注入造血干细胞中(时间约15 min左右)，充分混匀。

(4)将含低温保护剂的造血干细胞分装于低温保存袋内，每袋50～55 mL，小心排出袋内所有气泡，用高频热合仪封口，贴上条码。条码信息包括姓名、性别、年龄、住院号、样本类型、保存日期，操作者签名。置于4℃冰箱的样本盒内30 min。

(5)将低温保存袋(含低温保护剂的造血干细胞保存袋)移入程控降温仪内进行程序降温，或将低温保存袋置于样本盒内，再将样本盒置于-80℃冰箱内进行非程控降温。

5 造血干细胞复温与输注操作

(1)从-80℃冰箱或-196℃液氮中取出需要复温的造血干细胞保存袋并核对条形码。

(2)迅速将其投入40℃水浴中，不时摇动，尽量使样本在水浴中均匀受热，当袋内无有形冰并为液态(内部温度约4℃)时取出。

(3)DMSO去除法。无菌条件下，将含2.5%人血白蛋白的5%右旋糖酐40溶液推注入解冻后的低温保存袋内，在4～10℃温度下离心10 min，去除上清。如此重复1～2次，最后用上述溶液稀释造血干细胞悬液至原有体积。洗涤时加液量比例:若DMSO为10%，加入造血干细胞悬液容量的2倍量溶液进行离心；若DMSO为5%或以下，加入等量溶液进行离心。有报道，1次洗涤可使DMSO含量下降到原来的1/6[44]。

(4)也可不洗涤直接应用。无菌条件下，用50 mL注射器抽出含低温保护剂的造血干细胞，并给受者进行静脉推注，也可直接将保存袋内细胞输注给受者。

(5)细胞复温后或洗涤后至静脉推注或输注入患者体内的时间尽量在20 min内完成；如果含有块状物，用孔径约40 μm的滤器过滤，但滤器孔径不能太小，以避免造血干细胞损失。注意避光并观察患者是否有不良反应。

(6)检测项目包括细胞涂片形态分析、细胞计数、台盼蓝活体染色、CD34+细胞计数、微生物(细菌和真菌)培养、造血干细胞培养。

(7)填写实验报告。

6 注意事项

(1)各种器材和试剂均应购于符合国家标准、有相关批文的企业，标有生产厂家、名称、出厂日期、生产批准文号及有效期。

(2)每一步工作，包括离心、挤压、血浆去除、标志和冰冻都应尽量快和就近而无菌操作。每一步骤均应有2人或2人以上进行操作，并核对条形码编号。每步实验都有操作者及复核者的签名。

(3)每年至少1次质量检查，确保造血干细胞活性与分化能力。

(4)实验室、冰箱、储存罐有实时的温湿度监控与报警系统(采用电话、电邮方式)。

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Protocol for cryopreservation and thawing of hematopoietic stem cells(for discussion)

SHEN Jianliang1，HAN Ying2，HUANG Youzhang1
(1.Department of Hematology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Beijing Institute of Blood Transfusion，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100039，China)

The efficacy of cryopreservation of hematopoietic stem cells was influenced by a lot of factors，such as temperature，cooling rate，cell concentration，cryopreservative，thawing procedure，preserved period and measurement of cell functionalities.There were some differences in technology and methodology between research centers in the world，so the results from their publications could be poorly compared with each other and had a weak potency in evidence-based medicine.Except for the established protocol for cryostorage of mobilized peripheral blood(MPB)hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells(HSC/HPC)and bone marrow(BM)HSC/HPC in Joint Accreditation Committee of International Stem Cell Transplantation(ISCT)Europe and European Bone Marrow Transplantation(EBMT)(JACIE)guidelines，there was no guideline in China and the world.With the help of our experiences(for many years in cryomedical field)and related literatures we have drawn up this protocol for cryopreservation and thawing of hematopoietic stem cells suited for petty bank in hospital.Any comments or revisions will be welcome.

Hematopoietic stem cells；Cryopreservation；Thawing

R329

A

2095-3097(2015)05-0316-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.05.017

2014-08-25 本文编辑:张在文)

100048北京，海军总医院血液科(沈建良，黄友章)；100039北京，军事医学科学院北京输血研究所(韩 颖)