辛延乐 李艳花 张辉 杨兴旺 杨春彦 尉杰忠 刘春云 肖保国 马存根

Rho激酶抑制剂：治疗神经系统变性疾病的潜在药物

辛延乐 李艳花 张辉 杨兴旺 杨春彦 尉杰忠 刘春云 肖保国 马存根

近10年来，由于神经影像和分子生物学迅速发展，神经系统变性疾病的诊断取得了长足进步。相比之下，其治疗仍然举步维艰。了解神经变性的细胞和分子机制，寻找真实有效的干预靶点、提高疾病预防和治疗效果是临床神经科学迫切需要解决的现实问题。近年来人们发现诸多神经变性病呈现相似的病理和重叠的临床表现，它们之间存在类似的细胞和分子机制，免疫炎性反应形成的微环境是其共同的细胞学通路，而其中Rho激酶(ROCK)的异常激活可能是其共同的分子机制之一。研究表明通过抑制ROCK的活性能够减少免疫细胞的炎性反应、抑制中枢神经系统一氧化氮(NO)、白细胞介素1β (IL-1β )、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎性因子产生，改善炎性微环境保护神经元，同时抑制ROCK活性还可促进神经突触再生和神经干细胞动员分化。综上，ROCK抑制剂(Rho kinase inhibitor，RKI)有可能成为神经变性疾病的潜在药物。本文就RKI 治疗神经系统变性疾病的潜在可能和相应机制进行简要综述。

Rho激酶抑制剂；神经系统变性疾病；免疫炎性反应

神经系统变性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)和肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等已成为严重危害人类健康的疾病。不同类型的神经变性病变，除了受损部位和神经元不同之外，在组织病理学检查中，均可观察到神经细胞的染色变淡、萎缩，胞体表面不平，细胞核固缩或碎裂和胞质内虎斑溶解等组织病理学特征，临床研究和动物实验的证据发现脑内炎性反应与这些神经变性病的发生和发展密切相关，提示中枢神经系统(central nervous system，CNS)的免疫炎性反应可能是神经变性的共同通道[1]。激活的小胶质细胞、反应性星形胶质细胞、损伤的血-脑脊液屏障(blood brain barrier，BCB)、入侵的T细胞以及过度产生的炎性反应介质组成了神经炎性反应微环境。大量研究表明，诸多CNS变性疾病均存在Rho激酶( ROCK)的异常激活，推测ROCK可从不同的层面影响疾病的发生和发展。ROCK可能参与免疫炎性反应，神经突触异常和神经元变性，在神经变性网络中扮演轴心作用。因此，ROCK信号通路可能成为神经系统变性疾病的靶标。

1 免疫炎性反应：神经变性的共同通道

不同神经变性疾病都有各自不同的诱发炎性反应的特异机制，如不溶性β淀粉样肽(β-myloid peptide，Aβ)、α突触核蛋白(α-synuclein)、突变型超氧化物歧化酶1(mutant superoxide dismutase 1，SOD1)等炎性反应诱发物的产生途径和解剖位置决定了不同疾病的特异性。值得注意的是，在神经变性中小胶质细胞和星形胶质细胞被激活是炎性反应的共同现象。细胞因子〔如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)〕、炎性趋化因子、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(NO)可能是各种神经变性疾病中普遍存在的神经毒性因子，它们对周围神经元的存亡起着决定性的作用。

1.1 免疫炎性反应与MS MS是自身性T细胞引起CNS炎性级联反应导致的神经组织损伤。Th1和Th17自身反应性T细胞可通过分泌IFN-γ和TNF-α激活小胶质细胞和脑内炎性反应形成MS斑块，导致髓鞘病变伴轴突变性。如损伤和炎性反应是短暂，神经元髓鞘可再生；若慢性炎性反应持续存在，将导致轴突变性和神经元死亡。

1.2 免疫炎性反应与AD 尽管AD发病的分子基础目前还未完全阐明，但由Aβ沉积引发的神经免疫炎性反应在AD神经变性过程中起着重要作用，体外研究和动物体内试验的研究结果均表明异常沉积的Aβ可能是AD中炎性反应的激发因子，Aβ过度激活小胶质细胞，导致无法遏制的免疫炎性反应进行性损伤胆碱能神经元，同时导致患者认知功能障碍不断加重[2]。

1.3 免疫炎性反应与PD 研究表明免疫炎性反应与PD的病程发展密切相关。McGeer等[3]发现PD患者黑质致密部损伤神经元的周围存在激活的小胶质细胞和星形胶质细胞。此外，用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氢吡啶(1-methyl-4-henyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)诱导的PD动物模型中，除了黑质多巴胺能神经元的病变以外，受损神经元周围还存在大量激活的小胶质细胞和星形胶质细胞[4-6]。

1.4 免疫炎性反应与ALS ALS为一种严重的神经系统变性疾病，以脊髓、脑干、皮层的运动神经元选择性变性死亡为特点。近年来炎性反应机制在ALS发病中的作用逐渐得到关注[7]，该病的炎性反应是以星形胶质细胞和小胶质细胞增生和大量聚集为主要特征。有研究者利用PET技术证实了在ALS患者的运动皮层、前额背外侧皮层、丘脑、脑桥均有激活的小胶质细胞分布，而健康对照组未观察到上述现象。

2 ROCK抑制剂：治疗神经系统变性疾病的潜在药物

目前，临床使用的药物多数只能缓解神经系统变性疾病症状，不能影响疾病的进展。因此，了解神经变性疾病的细胞和分子机制，从而寻找真实有效的干预靶点，提高疾病的预防和治疗效果是临床神经科学迫切需要解决的现实问题。研究表明ROCK抑制剂(Rho kinase inhibitor，RKI)具备治疗神经系统变性疾病的诸多细胞和分子基础。首先，RKI具有明显的抑制免疫炎性反应的作用，可通过3个层面达到抗炎效果。(1)RKI能够抑制小胶质细胞产生NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性分子，改善炎性微环境从而保护神经元[8]。(2)在MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)和PD模型中，小胶质细胞激活表现为M1炎性细胞表型，而RKI可部分将M1炎性细胞转化为M2抗炎小胶质细胞[9]。(3)RKI可完善BCB或血脊髓屏障，阻止外周免疫炎性细胞浸润，抑制外周免疫炎性细胞的黏附和移行，减少由此引起的中枢神经系统炎性反应。其次，RKI具备突触再生的能力和内源性神经干细胞动员的潜能。因此，RKI有可能成为治疗神经系统变性疾病的理想药物。盐酸法舒地尔(Fasudil)是目前临床惟一使用的RKI，1995年作为治疗蛛网膜下腔出血药物在日本上市。

2.1 RKI与MS 在慢性EAE模型，ROCK 早期即可激活并迅速达到高峰，持续一段时间后有所下降。ROCK信号途径参与调节内皮细胞屏障功能和跨内皮细胞淋巴细胞迁徙，ROCK 激活可损害BCB和血脊髓屏障，增加外周反应性T细胞的浸润，促进和放大脑内的免疫炎性反应微环境，有助于髓鞘脱失和轴索破坏。RKI 可明显改善EAE临床症状和中枢神经系统的炎性反应及髓鞘脱失，显示了良好的治疗效果[10]。Feske等[11]指出，法舒地尔可以促进EAE小鼠神经轴突再生，减低血管通透性，抑制炎性细胞聚集和炎性因子的释放。本文作者所在课题组前期研究发现，腹腔注射法舒地尔可明显改善EAE小鼠临床症状，并可下调NF-κB[12]和抑制occludin的表达[13]，减少炎性浸润和髓鞘脱失，调节炎性M1小胶质细胞/巨噬细胞转化为抗炎M2细胞，从而减轻中枢神经系统炎性微环境。

2.2 RKI与AD AD模型脑内ROCK异常激活，推测可能参与AD的发生和发展。ROCK可以调节A β1-42的产生，抑制ROCK可减少Aβ1-42的产生。ROCK抑制剂除了被证明通过降低Aβ1-42水平减轻毒性而减轻变性外，还能通过β-分泌酶通路增加外功能区脱落[14]。另外，突触功能异常和突触丢失也被广泛认为是AD的细胞机制，其神经元突触较正常人可减少36%～46%，并与临床表现相关，但AD突触结构和功能异常的机制仍不清楚。ROCK激活可引起Aβ增加，从而使CRMP-2磷酸化而阻碍微管蛋白组装，导致神经突触抑制[15]。有研究发现抑制ROCK可增加海马锥体神经元突触密度和长度，改善空间学习和工作记忆[16]。法舒地尔治疗可明显减轻大鼠的空间学习和记忆功能损害，病理发现神经元受损较轻，并且IL-1β、TNF-α及NF-κB含量也明显下降。其原因可能是法舒地尔通过抑制炎性反应使Aβ1-42诱导引起的海马神经元变性程度减轻[17]。综上，Rho/ROCK信号通路可能参与免疫炎性反应，神经突触异常和神经元变性[18]，RKI可成为AD防治的靶标。

2.3 RKI与PD Villar-Cheda等[19]在PD小鼠模型中发现ROCK激活参与多巴胺神经元死亡。另有研究者发现α-synuclein可导致神经元轴突串珠样改变，而Aβ还可以促进α-synuclein诱导神经突触损害，提示了AD、PD和ROCK之间的潜在联系[20]。RKI 可减少神经元α-synuclein表达，增强PD模型多巴胺神经元的存活并减轻神经轴突损失，具有一定的干预和治疗PD的作用。在MPTP诱导的PD模型小鼠体内给药实验中，法舒地尔一方面可使PD模型小鼠的临床症状得到明显改善，还可促进小鼠体内DA能神经元的存活、抑制轴突损害等进而起到对神经元的保护作用[21]。Villar-Cheda等[19]应用C57BL-6小鼠成功建立MPTP诱导的PD模型，给予ROCK抑制剂Y-27632药物治疗，结果发现 PD模型黑质区域RhoA的表达和ROCK ⅡmRNA含量明显增多，并且ROCK活性也明显增强，证实了黑质多巴胺神经元的变性中存在ROCK信号通路的异常激活。该研究还发现Y-27632既能抑制小胶质细胞的活性，又能使DA能神经元的死亡速度减慢。

综上可见，变性疾病中，激活的小胶质细胞、反应性星形胶质细胞、损伤的BCB、入侵的T细胞以及过度产生的炎性介质组成了神经炎性反应，危害神经元的存活。尽管炎性反应并不一定是神经变性疾病的始发因素，但是持续的炎性反应会导致疾病的进行性加重，使炎性反应与神经元病变之间构成恶性循环，最终导致更多神经元的变性死亡。目前临床上的药物只能缓解症状，但不能影响疾病的进展。为了更有效地治疗神经变性疾病，阻断神经元继续变性死亡，控制疾病的发展，需要有新的治疗策略及药物，以限制致炎因子和氧化应激分子的过度产生，完善BCB或血脊髓屏障，阻止外周免疫炎性细胞浸润，在改善炎性微环境的同时促进和修复受损的神经组织和细胞。 RKI是目前已知兼备上述潜能药物，并且在动物实验上呈现了良好的治疗效果，有望成为治疗人类神经变性病的一个有效靶点。

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(本文编辑：邹晨双)

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.015

国家自然科学基金2012年面上项目(81272163)；山西省国际科技合作项目(2013081058)；山西省回国留学人员重点科研资助项目(2014-重点7)；山西中医学院“2011”培育计划项目(2011PY-1)；山西省自然科学基金项目(2008011082-1)

030001 山西医科大学第一临床医学院(辛延乐、张辉、马存根)；037009 山西大同大学脑科学研究所(辛延乐、李艳花、张辉、杨兴旺、 杨春彦、 尉杰忠、刘春云、马存根)；030024 山西中医学院“2011”协同创新中心/国家卫生部临床重点专科(杨兴旺、杨春彦、马存根)；200025 复旦大学华山医院神经病学研究所(肖保国)

马存根，Email：macungen2001@163.com

Q781；R741.05

A

1006-2963 (2015)04-0288-04

2014-10-08)