侯志涛 韩玉生 熊圣彪 刘翼天 韩晓霞 孙红芳 李东东 尹祖贤

D半乳糖诱导结合双血管结扎建立脑缺血大鼠模型及其评价

侯志涛 韩玉生 熊圣彪 刘翼天 韩晓霞 孙红芳 李东东 尹祖贤

目的 通过D半乳糖(D-gal)诱导结合双血管结扎的方法建立一种能较好地模拟人类脑缺血的动物模型，并对该模型进行评价。方法 以3月龄青年SD大鼠为实验对象，采用D-gal连续皮下注射6周结合双血管结扎的方法制备脑缺血动物模型。以Garcia量表评价大鼠的神经功能损伤的严重程度；血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)水平评价机体氧自由基代谢情况；TTC染色评价大鼠脑梗死体积；HE染色评价缺血区脑组织损伤的严重程度。结果 模型组(10.375±1.188)和半乳糖模型组Garcia评分(7.167±4.714)均低于空白组(20±0；均P<0.01)，半乳糖模型组Garcia评分低于模型组(P<0.05)。与模型组比较，半乳糖模型组大鼠SOD〔(393.60±19.02)U/mLvs. (469.37±22.63)U/mL〕和GSH-Px(1116.38±76.88vs. 1413.22±102.74)活性降低(均P<0.05)，MDA〔(17.58±0.84)mmol/mLvs. (10.89±1.08)mmol/mL〕水平升高(P<0.05)。与模型组比较，半乳糖模型组梗死体积分数(35.75±2.38vs. 24.23±1.92)明显增大(P<0.01)。模型组大鼠缺血区表现为神经元细胞肿胀变性溶解，白质疏松等异常病理变化，半乳糖模型组较模型组更为严重。结论 该模型能够较好地模拟人类脑缺血。

脑缺血模型；D半乳糖；双血管结扎

脑缺血(cerebral ischemia)是一种常见的脑血管疾病，是由于脑组织对缺血缺氧反应敏感所致。研究发现，当大鼠每100 g体质量脑血流量降至15 mL/min以下持续2 h即可导致不可逆的脑细胞损伤[1]。机体老化是导致脑血流量降低和氧自由基代谢异常的主要因素[2-3]，当按体质量2 mL/(kg·d)给予 3月龄青年SD大鼠7.5 %(质量浓度)D半乳糖(D-gal)皮下注射后6周即可使其机体表现为24月龄衰老大鼠的表现[4]。中枢神经元损伤导致相应神经功能受损是主要的临床表现，也是评价脑缺血后疾病严重程度及治疗后恢复程度的重要标准[5]。本实验根据脑缺血的疾病特点，采用D-gal诱导大鼠机体衰老结合双血管结扎的方法建立一种能较好的模拟人类脑缺血的动物模型并对这一模型进行评价。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物：健康清洁级3月龄雄性SD大鼠〔购自黑龙江中医药大学动物安全评价中心；实验动物生产许可证号：SCXK(黑)2013-004，使用许可证号：SYXK(黑)2013-012〕70只，体质量(125±5)g。采用随机数字法将大鼠随机分组，标准啮齿类动物饲料喂养，饮食饮水自由，动物房内温度18～25℃，相对湿度40%～50%，自然光照，保证动物房安静，整洁，通风。

1.1.2 主要仪器及试剂：D-gal(美国 Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；722型可见分光光度计(上海光谱科技有限公司)；Image-pro plus6.0病理图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)；Nikon eclipse 50i 光学显微镜(日本株式会社)，其余产品均为市售分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 造模及分组：将70只3月龄SD大鼠随机分为空白组(15只)、半乳糖组(15只)、模型组(20只)及半乳糖模型组(20只)。模型组正常饲养6周后，参照Ni等[6]的造模方法制备脑缺血大鼠模型。大鼠在手术开始前24 h禁食，前12 h禁水。用10 %(质量浓度)水合氯醛以体质量3 mL/kg给大鼠进行腹腔注射麻醉，待麻醉深度达到手术指征后将大鼠放于手术台进行消毒，在大鼠颈部正中做一纵向切口，分离出双侧颈总动脉，分别结扎大鼠双侧颈总动脉的远心端和近心端。并从中间剪开，保证完全阻断颈总动脉血流，逐层缝合。半乳糖组用7.5 %(质量浓度)D-gal以体质量2 mL/(kg·d)皮下注射6周，制备大鼠衰老模型[5]。半乳糖模型组先以半乳糖组相同方法制备大鼠衰老模型[5]然后参照Ni等[6]的造模方法制备脑缺血大鼠模型。空白组正常饲养，不作任何处理。造模结束24 h后盲法进行Bederson评分[7]作为脑缺血模型成功入组的评定标准，评分低于2分的大鼠剔除。Bederson评分的4个等级包括：0分：没有任何神经损伤的症状；1分：悬尾试验时不能完全伸展对侧前爪；2分：前肢抵抗对侧的推力能力下降；3分：向对侧转圈。最终模型组入组大鼠为8只(成功率为40%)；半乳糖模型组入组大鼠为12只(成功率为60%)。

1.2.2 大鼠神经功能评价： 造模结束24 h后对各组大鼠盲法进行Garcia评分[8]，从大鼠自主的运动情况、体态的对称性、前肢伸展的功能、网屏实验、身体双侧的触觉以及双侧胡须的反射6个方面评定大鼠神经功能损伤的严重程度，功能正常时得分最高18分，功能损伤最严重者得分最低3分。

1.2.3 SOD、GSH-Px活性及MDA水平的测定：各组大鼠神经功能评价结束后，立即将大鼠麻醉，心脏取血，将血液导入真空采血管中。室温静置0.5 h后，以3300 r/min(离心半径=18 cm)离心10～15 min后分离血清，SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA采用TBA缩合比色法，GSH-Px测定采用DTNB显色法，三者均用722型可见分光光度计测量。

1.2.4 脑梗死体积测定[9]：各组动物完成神经功能评价后，用10 %(质量浓度)水合氯醛以体质量3 mL/kg腹腔注射麻醉，心脏取血后，立刻开颅取脑，自视交叉前4 mm起其后做连续冠状切片(厚度为2 mm)，共取6片，将切片置于1%(质量浓度)TTC染液中，37℃避光孵育30 min，正常脑组织呈深红色，梗死的脑组织不能着色呈现苍白色。用数码相机按固定比例进行正反两面拍照，经Photoshop软件测定各切片正反两面的梗死灶面积，正反两面面积平均值乘以厚度，得出梗死灶体积，并按照公式“脑梗死体积分数=V梗死体积/V脑体积×100%”计算梗死体积分数。

1.2.5 缺血区脑组织损伤观察：将各组大鼠脑组织置于4%(质量分数)甲醛溶液中固定48 h ，取缺血区脑组织经浸蜡包埋制作石蜡切片，切片厚度为6 μm，切片脱蜡、水洗，苏木素染色5 min，1%(体积分数)盐酸酒精分化，水洗，伊红(HE)染色3 min，脱水、透明、封片。每只大鼠缺血区间切片隔10张取1张，每张切片观察2个400倍视野，主要观察双侧颈内动脉供血区神经元、白质纤维、炎性细胞及胶质细胞等的变化情况。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评价 结果见表1。模型组和半乳糖模型组Garcia评分均低于空白组(P<0.01)，且半乳糖模型组Garcia评分低于模型组(P<0.05)。

2.2 脑梗死体积的测定 空白组及半乳糖组未见梗死灶；与模型组梗死体积分数〔(24.23±1.92)%〕比较，半乳糖模型组〔(35.75±2.38)%〕明显增大(P<0.01)(图1)。

2.3 各组大鼠缺血区脑组织损伤观察 空白组和半乳糖组神经元及脑白质等结构未见明显的病理变化。模型组与半乳糖模型组大鼠缺血区均出现神经元细胞肿胀变性溶解，白质疏松，胞质嗜酸性减弱，炎细胞浸润明显增多，边缘区大量神经细胞坏死，炎细胞浸润明显，少量胶质细胞增生，半乳糖模型组较模型组损伤更为显著(图2)。

注：与空白组比较，*P<0.01；与半乳糖组比较，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；

A：空白组；B：半乳糖组；C：模型组；D：半乳糖模型组

图1 各组大鼠缺血区表现：图中箭头所示为脑梗死区域(TTC)

A：空白组；B：半乳糖组；C：模型组；D：半乳糖模型组

图2 各组大鼠基底节区缺血区表现：图中红色箭头所指为白质纤维，黑色箭头所指为神经元(HE)

2.4 各组大鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA水平比较 结果见表1。与空白组比较，其他三组血清SOD活性明显降低(P<0.01)，MDA水平升高(P<0.01)，模型组及半乳糖模型组GSH-Px活性明显降低(P<0.01)；与半乳糖组比较，模型组、半乳糖模型组SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)、MDA水平升高(P<0.05)；与模型组比较，半乳糖模型组大鼠SOD、GSH-Px活性降低、MDA水平升高(P<0.05)。

3 讨论

动物模型制作应能够较好地模拟人类疾病，将主要的发病因素考虑在内，并且具备制作简便、可重复性强、模型评价相对明确等特点。本研究基于公认的慢性脑缺血模型结合国内外研究建立了D-gal诱导后制作大鼠脑缺血模型方法，即先将3月龄青年SD大鼠给予D-gal诱导，使动物发生一系列的类似于人类老年期机体衰老的表现，再制作脑缺血模型。研究显示，伴随着机体老化体内各种新陈代谢速度减慢，血流动力学和血液流变学发生一定程度的改变。老年期血管内皮变薄、胶原蛋白以及弹性蛋白增加，微血管相关蛋白水平下降，脑内β淀粉样蛋白、脂褐素大量沉积、免疫力低下等均可以导致脑组织缺血缺氧的风险增加[10]。同时脑老化可以导致脑内cDNA甲基转移酶活性降低，染色质活性下降，影响正常基因的表达。近年来，大多数研究者对脑缺血的研究，倾向于选择梗死体积较大、神经功能缺损较重和神经细胞肿胀坏死程度较高的模型。造模的可操作性以及成活率也是通常被考虑的重要因素[11]。而老年大鼠生理上存在血管迂曲、严重的动脉硬化以及易感其他未知疾病等因素均使得造模死亡率高、稳定性和重复性差，最终导致不能使用自然衰老的大鼠制作脑缺血动物模型[12]。因此，将机体老化这一重要因素融入当下脑缺血动物模型的研究，再结合双血管结扎导致脑内出现广泛的供血供氧不足以及自由基过度堆积等病理变化，进而使该模型更接近于人类脑缺血的发生发展。

本研究发现，与模型组比较，半乳糖模型组大鼠神经功能Garcia评分(7.167±4.714vs. 10.375±1.188，P<0.05)、脑内梗死体积分数(35.75±2.38vs. 24.23±1.92，P<0.01)、炎性细胞浸润以及神经细胞肿胀程度等方面均呈现出损伤较重的表现，并且该模型体现了稳定性高、造模成功率较高的优点，也提示D-gal诱导青年大鼠衰老是较好的制作脑缺血模型途径。

脑缺血时机体可以产生大量的自由基，自由基不断地侵袭不饱和脂肪酸侧链，产生一系列的连锁反应，最终导致了脑组织神经细胞受到过氧化损害、凋亡坏死[13]。有研究显示用SOD预处理实验动物，可以有效的阻止动物脑组织缺血性细胞凋亡的发生[14]。大量临床研究表明，缺血性脑卒中患者血清SOD、GSH-Px活性降低，MDA水平升高[15]，并且认为这一普遍表现可作为对脑缺血严重程度评价的重要参考标准。本研究发现，与其他三组比较，半乳糖模型组MDA水平明显升高，SOD、GSH-Px活性明显降低，这一特点与缺血性脑卒中患者临床血液学表现[15]完全一致，也提示该模型与人类脑缺血的病理变化较为接近，并且与脂质过氧化反应有密切的关系，自由基连锁反应可能是参与该疾病模型病理过程的重要因素。

综上可见，本研究发现，D-gal诱导结合双血管结扎制作的脑缺血大鼠模型能够较好地模拟人类脑缺血的发病特点，并且基本满足稳定性高、重复性好、造模成功率高的特点，同时该模型存在明显神经功能缺损症状，是较为理想的脑缺血大鼠模型，适用于脑缺血机制及药物疗效评价的研究。

[1]Zhang RL, Chopp M, Chen H, et al. Postischemic (1 hour) hypothermia significantly reduces ischemic cell damage in rats subjected to 2 hours of middle cerebral artery occlusion[J]. Stroke,1993，24(8):1235-1240.

[2]Slemmer JE, Shacka JJ, Sweeney MI, et al. Antioxidants and free radical scavengers for the treatment of stroke, traumatic brain injury and aging[J].Curr Med Chem,2008,15(4):404-414.

[3]Xu K, Puchowicz MA, Sun X, et al. Mitochondrial dysfunction in aging rat brain following transient global ischemia[J].Adv Exp Med Biol, 2008, 61(4): 379-386.

[4]Zhong Y,Hu YJ,Chen B，et al. Mitochondrial transcription factor： A overexpression and base excision repair deficiency in the inner ear of rats with d-galactose-induced aging[J]. FEBS J, 2011, 278(14):2500-2510.

[5]Toda N, Ayajiki K, Okamura T. Cerebral blood flow regulation by nitric oxide: recent advances[J]. Pharmacol Rev, 2009, 61(1): 62-97.

[6]Ni JW, Marsumoto K, Li HB, et al. Neuronal damage and decrease of central acetylcholine level following permanent occlusion of bilateral common carotid arteries in rat[J].Brain Res,1995,673(2):290-296.

[7]Bederson JB, Pitts LH, Tsuji M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke,1986,17(3):472-476.

[8]Garcia JH, Wagner S, Liu KF, et al. Neurological deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Statistical validation[J]. Stroke,1995,26(4):627-634.

[9]Derugin N,Wendland M,Muramatsu K, et al.evolution of brain injury after transient middle cerebral artery occlusion in neonatal rats[J].Stroke,2000,31(7):1752-1761.

[10]Davis M, Mendelow D, Perry RH, et al. Experimental stroke and neuroprotection in aging rat brain[J]. Stroke, 1995, 26: 1072.

[11]Tureyen K, Brooks N, Bowen K, et al.transcription factor early growth response-1 induction mediates inflammatory gene expression and brain damage following transient focal ischemia[J].J Neurochem,2008,105(4):1313-1324.

[12]Popa-Wagner A, Schroder E, Schmoll H, et al. Upregulation of MAP1B and MAP2 in the rat brain after middle cerebral artery occlution: Effect of age[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1999, 19:425-434.

[13]曲忠森,任晓燕,葛宝林,等. 地塞米松对鼠脑缺血-再灌注损伤时海马谷氨酸转运体功能的影响[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,1999,6(3):161-164.

[14]Csiszar A, Smith K, Labinskyy N, et al. Resveratrol attenuates TNF-alpha-induced activation of coronary arterial endothelial cells: role of NF-kappab inhibition[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 291(4): H1694-1699.

[15]Demirkaya S, Topcuoglu MA, Aydin A, et al. Malondialdehyde, glutathione peroxidase and superoxide dismutase in peripheral blood erythrocytes of patients with acute cerebral ischemia[J]. Eur J Neurol,2001, 8(1):43-45.

(本文编辑：邹晨双)

Establish and evaluation of rat cerebral ischemia model induced by D-galactose combined with ligation of bilateral common carotid arteries

HOUZhitao,HANYusheng*,XIONGShengbiao,LIUYitian,HANXiaoxia,SUNHongfang,LIDongdong,YINZuxian.Heilongjiang

UniversityofChineseMedicine,HarbinHeilongjiang150040,China

HAN Yusheng, Email：hysh1973@126.com

Objective To established animal model by D-galactose(gal)-inducing and double vascular ligation, and simulate the human brain ischemia and evaluate the model. Methods Cerebral ischemia models were established by the method of D-gal injected subcutaneously for 6 weeks and then the operation of bilateral carotid artery ligation was taken in 3 month young Sprague-Dawley (SD) rats. The criteria of a successful model was evaluated by Bederson scale and the neurological dysfunction severity caused by cerebral ischemia was evaluated by Garcia scale. The serum superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GSH-Px) activity and Malondialdehyde(MDA) content were detected by chemical colorimetric method. The infarct size was evaluated by TTC staining. The injury severity of brain ischemic tissue was evaluated by HE staining. Results Compared to the blank group(20±0), Garcia score of the model group(10.375±1.188)and the D-gal model group(7.167±4.714)showed significant differences (P<0.01). Compared to the model group, Garcia score of the D-gal model group(7.167±4.714vs. 10.375±1.188)decreased (P<0.05). Compared with the model group, serum SOD[(393.60±19.02)U/mLvs. (469.37±22.63)U/mL], GSH-Px(1116.38±76.88vs. 1413.22±102.74)activity of the D-gal model group were decreased (P<0.05 respectively), MDA[(17.58±0.84) mmol/mLvs. (10.89±1.08)mmol/mL] content increased (P<0.05). Compared with the model group, infarct volume percentage(35.75±2.38vs. 24.23±1.92)of the D-gal model group significantly increased(P<0.01). Abnormal pathological changes of swelling, degeneration, dissolution and leukoaraiosis were observed in ischemic area neurons of the model group. The pathological changes of the D-gal model group was more serious than the model group. Conclusions The model can simulate the human brain ischemia and it was an ideal animal model for the pathogenesis of brain ischemia.

cerebral ischemia model; D-galactose; bilateral carotid artery ligatio

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.007

黑龙江中医药大学大学生科技创新基金资助项目(038002)

150040 黑龙江中医药大学

韩玉生，Email：hysh1973@126.com

R734

A

1006-2963 (2015)04-0255-05

2014-11-09)