张筠 邓在春 马红映 吕丹 汪丽

1．宁波大学医学院附属医院呼吸科，浙江宁波315000；2．宁波大学医学院附属医院细菌室，浙江宁波315000

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制及同源性分析

张筠1邓在春1马红映1吕丹1汪丽2

1．宁波大学医学院附属医院呼吸科，浙江宁波315000；2．宁波大学医学院附属医院细菌室，浙江宁波315000

目的探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制，并进行同源性分析。方法选择2010年1月～2014年12月189株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株进行分析，采用Hodge方法测定碳青霉烯酶表型，采用B－last方法测定超广谱β内酰胺酶、PCR进行耐药基因测序，REP－PCR方法进行同源性分析。结果189株菌株对厄他培南、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、美洛培南、头孢西丁的耐药率均超过90%。对米诺环素的耐药率相对较低，对替加环素的耐药率为0。改良Hodge法检测碳青霉烯酶阳性率79．9%，广谱β－内酰胺酶检测阳性率54．0%。KPC基因阳性率60．3%，IMP基因阳性率3．7%；Amp－C酶基因阳性率12．7%；162株blaSHV阳性，阳性率85．7%，其中blaSHV-11为优势基因；120株blaTEM阳性，其中blaTEM-1为优势基因；90株blaCTM-M阳性，其中blaCTM-M-14为优势基因。同源性分析结果显示G型比例最高，占55．0%，其次为J型，占16．4%。结论耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制复杂，以G型克隆株为主。临床工作中应根据药敏结果规范使用抗菌药物。

碳青霉烯类；耐药；肺炎克雷伯菌；同源性分析;超广谱β内酰胺酶

碳青霉烯类抗生素具有抗菌作用强、抗菌谱广的特点，是目前治疗多重耐药革兰阴性细菌的重要药物[1]。但是近年来，临床上对碳青霉烯类耐药率逐渐升高。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株的耐药机制复杂，其中产生碳青霉烯酶就是重要机制之一[2，3]。本研究通过对189株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株进行研究，分析其耐药机制以及同源性。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与试剂

选择2010年1月～2014年12月在我院分离出的189株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行研究。189株菌株中58株分离于痰液，47株分离于血液标本，34株分离于尿液，33株分离于胸腔积液，17株分离于分泌物。MHA培养基、血琼脂平板、亚胺培南、厄他培南、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶/克拉维酸、美罗培南、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶、头孢西丁、呋喃妥因、四环素、复方磺胺甲唑、妥布霉素、阿米卡星、替加环素，环丙沙星药敏纸片，PCR试剂盒，DNA Marker，PCR扩增引物。全自动微生物鉴定仪、恒温培养箱、PCR扩增仪、凝胶成像系统等。

1.2 研究方法

1．2．1 药敏试验采用E－test方法检测抗菌药物对菌株的MIC，厄他培南采用纸片扩散检测抑菌圈。E－test方法：将待测菌株涂在MH平板，均匀涂抹，干燥3～10 min，将E－test条放在平板上，37℃，培养20 h后观察结果。纸片扩散：将待测菌株涂在MH平板，均匀涂抹，干燥3～10 min，中央贴厄他培南纸片一张，测量抑菌圈。结果根据2012年CLSI M100－S22文件标准进行判断。

1．2．2 改良Hodge试验大肠埃希菌ATCC25922采用直接菌落悬液方法制备0．5麦氏浊度菌悬液，用8．5 g/L氯化钠溶液1∶10稀释，涂在MH琼脂平板上，干燥3～10 min，中央贴美洛培南纸片。用拭子挑3～5个待测菌菌落或者质控菌悬液，从纸片边缘到平板边缘划直线的方式接种，37℃培养20 h。MHT阳性：接种先与大肠埃希菌抑菌环交接产生向抑菌圈内增强生长现象，说明待测菌产生碳青霉烯酶。

1．2．3 超广谱β-内酰胺酶检测待测菌0．5麦氏浊度，均匀涂在MH平板，干燥3～10 min，贴头孢他啶/克拉维酸、头孢他啶、头孢噻肟/克拉维酸。37℃孵育18 h，任一复合纸片抑菌环直径与单一纸片抑菌环直径相比≥5 mm，则为产超广谱β－内酰胺酶。

1．2．4 耐药基因PCR检测制备耐药基因检测模板。采用PCR扩增法检测碳青霉烯酶基因。获得的基因阳性菌株PCR扩增产物提纯，进行双向测序，结果与已知序列比对。

1．2．5 菌株同源性分析采用REP－PCR方法进行基因扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，染色，成像后拍照。根据电泳条数、长度进行同源性分析。

1.3 统计学分析

采用EXCEL表格统计数据，采用SPSS12．0统计学软件进行数据分析。计数资料采用n（%）表示，采用χ2检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药分析结果

189株菌株对厄他培南、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、美洛培南、头孢西丁的耐药率均超过90%。对米诺环素的耐药率相对较低，对替加环素的耐药率为0。见表1。

表1 耐药分析结果（n=189）

2.2 碳青霉烯酶检测结果及超广谱β-内酰胺酶检测结果

改良Hodge法检测碳青霉烯酶阳性率79．9%（151/189），超广谱β－内酰胺酶检测阳性率54．0%（102/189）。以PCR结果为金标准，改良Hodge法检测碳青霉烯酶存在假阳性和假阴性的情况，但是统计学比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。见表2。

表2 Hodge与PCR碳青霉烯酶基因检测结果比较[n（%）]

2.3 耐药基因测序及序列分析

KPC基因阳性率60．3%，IMP基因阳性率3．7%，Amp－C酶基因基因阳性率12．7%；162株blaSHV阳性，阳性率85．7%，其中blaSHV-11160株，为优势基因；120株blaTEM阳性，阳性率63．5%，其中blaTEM-196株，为优势基因；90株blaCTM-M阳性，阳性率47．6%，其中blaCTM-M-1468株阳性。1株菌株同时含blaKPC-2和blaIMP-4基因，3株同时有blaCTM-M-14基因和blaCTM-M-65基因，126株同时含有3种及以上耐药基因。耐药基因测序及序列分析见表3。

2.4 同源性分析

G型比例最高，占55．0%，其次为J型，占16．4%。见表4。

表3 耐药基因测序及序列分析（n=189）

表4 REP-PCR同源性分析（n=189）

3 讨论

肺炎克雷伯菌是革兰阴性杆菌，是临床上常见的病原菌，细菌有荚膜，主要的感染部位是肺部。随着广谱抗菌素在临床上的应用，ESBLs、AmpC酶、AMEs产生，目前多重耐药情况严重[4-6]。ESBLs产生、外膜孔蛋白缺失、形成生物被膜是肺炎克雷伯菌的主要耐药机制[7，8]。

亚胺培南是最早研发的碳青霉烯类抗菌药物，在1987年问世，是第一代碳青霉烯类抗菌药物，随后出现帕尼培南。1995年后，研发出第二代碳青霉烯类抗菌药物，主要是美洛培南和厄他培南。目前第三代碳青霉烯类抗菌药物已经在临床上应用，其具有更强的抗铜绿假单胞菌活性，并且有口服剂型。碳青霉烯类抗菌药物具有广谱和强大的抗菌活性，能够迅速杀菌，减少细菌内毒素的释放，对临床常见的β内酰胺酶（例如AmpC）具有高度的稳定性，对肠杆菌科细菌具有高度的敏感性，临床疗效肯定，血液透析能够清除[9，10]。既往，临床上对碳青霉烯类抗菌药耐药的菌株较少见。但随着抗菌药物在临床上的不规范使用，耐药菌逐渐出现，为临床上的治疗造成困难。

肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类的耐药机制十分复杂，与产生碳青霉烯酶、AmpC酶过度表达、外膜孔蛋白丢失、高亲和碳青霉烯类的位点数量下降或缺失，或者亲和力下降等有关[11，12]。而碳青霉烯酶的产生是重要的耐药机制之一。碳青霉烯酶由耐药菌株产生，属于一类β-内酰胺酶，能够水解碳青霉烯类药，这类酶有丝氨酸酶以及金属酶[13-15]。既往研究显示，肺炎克雷伯菌主要产生的碳青霉烯酶主要是A类和B类，而A类为丝氨酸酶，其中KPC型最常见，能够被克拉维酸所抑制；B类为金属酶，以IMP、VIM、GIM多见，能够解除氨曲南之外所有的β-内酰胺类抗生素[16-20]。

本次纳入研究的189株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株中，耐药分析结果显示，其对厄他培南、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、美洛培南、头孢西丁的耐药率均超过90%，而对替加环素的耐药率为0，说明其对替环加素具有较好的敏感性，而对阿米卡星、妥布霉素、米诺环素等也具有一定的敏感性。耐药菌株的基因多样，且可同时表达多个耐药基因，这给临床上的治疗造成了极大的困难。替加环素是新型四环素类药物，对多重耐药的G-杆菌具有较好的抗药活性。根据本次研究的结果，在临床工作中，对于多重耐药的肺炎克雷伯菌，可首选替加环素治疗。

189株待测菌株采用Hodge试验检测，结果显示碳青霉烯酶阳性率为79.9%，以PCR方法为标准，该结果高于PCR检测结果，说明存在一定的假阳性。但是对两种检测方法的符合情况进行统计学分析，结果显示两种检测方法差异无统计学意义（P＞0.05）。

耐药基因序列分析结果显示，KPC基因阳性率60.3%，IMP基因阳性率3.7%，而其中1例同时有KPC基因和IMP基因，因此，120株耐药菌株因产生碳青霉烯酶而耐药，占63.5%。另外，189株耐药菌Amp-C酶基因、超广谱β-内酰胺酶基因携带率高。162株blaSHV阳性，阳性率85.7%，其中blaSHV-11160株，为优势基因；120株blaTEM阳性，阳性率63.5%，其中blaTEM-196株，为优势基因；90株blaCTM-M阳性，阳性率47.6%，其中blaCTM-M-1468株阳性。本研究还发现126株同时含有3种及以上耐药基因，可能是多重耐药的基因基础，说明耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制十分复杂，临床治疗也会越来越困难。耐药基因同源性分析结果显示，本医院分离出的耐药菌株以G型为主，其次为J型，其他类型相对较少。

综上所述，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制复杂，在同一医院流行的耐药菌株具有相似的基因型以及耐药表型，可能与地区流行以及院内感染有关，因此在临床工作中，院内感染应重点关注多重耐药菌株的传播。另外，在临床工作中，对抗菌药物的选用，应根据药敏结果以及感染部位的血药浓度等选择最合适的药物治疗，规范化使用抗生素，减少耐药菌株的产生。

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Analysis of resistance mechanisms and homology of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

ZHANG Yun1DENG Zaichun1MA Hongying1LV Dan1WAGN Li2
1．Department of Respiration,the Affiliated Hospital of Medical College of Ningbo University,Ningbo315000,China; 2．Bacteriology Room,the Affiliated Hospital of Medical College of Ningbo University,Ningbo315000,China

Objective To analyze resistance mechanisms and homology of carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniae．Methods From January 2010 to December 2014,189 carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniaes were analyzed, carbapenemases phenotype by Hodge,ESBLs was tested by B－last,resistance gene sequencing was tested by PCR,homologous points was detected by REP－PCR．Results Resistance rates of 189 strains to ertapenem,cefotaxime,ceftazidime,imipenem,amoxicillin/clavulanic acid,aztreonam,meropenem,cefoxitin were more than 90%．Resistance rate to minocycline was low,and to tigecycline was 0．Carbapenemases phenotype positive rate by Hodge was 79．9%，and ESBLs was 54．0%．KPC gene positive rate was 60．3%；IMP was 3．7%;Amp－C was 12．7%;162 strains of blaSHVwas positive,accounting on 85．7%,and blaSHV-11was dominant gene;120 strains of blaTEMwas positive,and blaTEM-1was dominant gene;90 strains of blaCTM-Mwas positive,and blaCTM-M-14was dominant gene．Homology analysis showed that G－type was the highest proportion of 55．0%,followed by J－type,accounting for 16．4%．Conclusion Resistance mechanisms of carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniae is complex,and G－type clone is main clone．The use of antibiotics should be based on susceptibility results．

Carbapenems;Resistance;Klebsiella pneumoniae;Homology analysis;ESBLs

R446.5

A

1673-9701（2015）27-0016-04

2015-08-10）

浙江省宁波市医学科技计划项目（2013A19）