许玉兵 丁方平

1.杭州市富阳中医骨伤医院检验科，浙江富阳311400；2.杭州市富阳中医骨伤医院针灸推拿科，浙江富阳311400

慢性骨髓炎病原菌菌谱及药敏分析

许玉兵1丁方平2

1.杭州市富阳中医骨伤医院检验科，浙江富阳311400；2.杭州市富阳中医骨伤医院针灸推拿科，浙江富阳311400

目的了解慢性骨髓炎感染病原菌的菌群分布及药敏情况，指导临床合理使用抗菌药物。方法通过对288份骨髓炎分泌物的培养和药敏试验。结果共培养出细菌283株，G+菌123株，G-菌160株。结论感染的首位病原菌仍是金黄色葡萄球菌，但G-菌的感染率在不断上升占到53%，大于G+菌的感染。喹诺酮类、克林霉素对G+菌的敏感率较高，均在80%以上，一、二代头孢菌素对G-病原菌敏感率较低，均低于35%，三、四代头孢菌素、喹诺酮类、哌拉西林/他巴唑、亚胺培南尚有较高的敏感率。

慢性骨髓炎；病原菌；药敏

慢性骨髓炎病程长、治疗困难、易复发，一直是骨科医师面临的一大临床难题[1]。慢性骨髓炎的病情复杂，病程较长，治疗的失败率和复发率也较高。自20世纪80年代起，败血症减少，因败血症引起的急性血源性骨髓炎也相应减少。但创伤性骨髓炎和慢性骨髓炎日渐增多，以往有典型表现者少见，症状不典型者增多，致误诊、漏诊增多，丧失了最佳治疗时机[2]。抗生素治疗是慢性骨髓炎的主要手段和方法之一，由于抗生素的广泛使用，临床上产生了不少的耐药菌株，增加了该病的治疗难度和治疗周期。既增加患者的痛苦，又消耗了更多的医疗资源。因此了解慢性骨髓炎感染菌株分布的特点及其耐药情况变得尤为重要。为此，于2011～2014年间我院收集的288例骨髓炎分泌物标本进行了细菌培养和药敏试验，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年1月1日～2014年12月31日我院收治的288例慢性骨髓炎患者，依照《坎贝尔骨科学》标准诊断为慢性骨髓炎，其中108例为急性骨髓炎转变而来，180例为开放性骨折引发的骨髓炎。男210例，女78例。发病部位：胫腓骨160例，肱骨48例，股骨35例，指部23例，足部22例。所有标本都有临床医生按照无菌操作流程采集的窦道分泌物或手术中采集的肉芽组织或死骨。

1.2 材料与药物

1.2.1 材料血琼脂平板（法国梅里埃生产哥伦比亚血琼脂平板，规格90 mm）电热恒温培养箱、35℃，（上海精宏实验设备有限公司制造）无菌棉拭子（法国梅里埃生产，产品标号155C。

1．2．2抗菌药物[GP－AST药敏板]青霉素G、利福平、呋喃妥因、四环素、莫西沙星、左氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、复方新诺明、克林霉素、替考拉宁、红霉素、苯唑西林、万古霉素。[GN－AST药敏板]亚胺培南、左氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、阿米卡星、环丙沙星、庆大霉素、氨曲南、头孢曲松、头孢拉定、妥布霉素、头孢挫啉。

1.3 方法

临床采集的标本在2 h内接种于血平板上，经35℃、24 h培养，生长菌落行革兰染色，如果染色为G+细菌，用VITEK－2的专用的GP鉴定板上机鉴定，药敏则采用GP－AST板做药敏检测。染为G－细菌则用VITEK－2专用的GN鉴定板进行鉴定，用GN－AST药敏板进行药敏检测。所有鉴定和药敏在24 h内由仪器自动完成并给出完整报告。一个病例只收集一次结果，无重复培养和药敏结果。

1.4 统计学方法

采用SPSS19．0统计学软件分析，表1为分离到的细菌以及各自所占构成比。表2为主要三种G+病原菌的敏感例数/敏感率%，表3为主要三种G－病原菌的敏感例数/敏感率%。

2 结果

2.1 细菌培养结果

288例标本有细菌生长的有224例，阳性率77．7%，其中12例有三种细菌生长，35例有两种细菌生长，共检出菌株283株。总共检出15种细菌。见表1。

2.2 药敏结果

所有检出细菌行药敏试验，见表2、3。

表1骨髓炎病原菌检出构成比（%）

3 讨论

表2主要G+对15种抗生素的敏感率[n（%）]

3.1 慢性骨髓炎致病菌菌谱的特点

本组标本共检出15种细菌。前五位排序为金黄色葡萄球菌（29．0%）＞铜绿假单胞菌（17．7%）＞阴沟肠杆菌（13．8%）＞大肠埃希菌（8．8%）＞溶血葡萄球菌（7．8%）。和谢克恭等[3]报道的文献一致。但与刘伯让等[4]报道文献略有差异，其排列首位的病原菌为铜绿，而我们检出的首位则是金黄色葡萄球菌。与张双江等[5]报道的有较大差异，其报道中G+菌比例占80%，可能由于长期用药习惯的地区差异导致了临床阳性病原菌的不同，其真正原因有待研究。其中G+菌共检出123株，占43%，G－菌160株，占53%。G－菌的感染率要大于G+菌，前五位中G－杆菌占多数达52%，说明随着抗生素的长期应用，一些正常寄生菌或自然界总正常菌群的感染率在上升，同时由于在骨科感染治疗时偏重于G+菌的抗生素的使用，产生了一定的抑阳扶阴的作用，须引起足够重视。同时本组试验有20%的标本无菌生长，但不表示一定没有细菌，一些厌氧菌、L型细菌，苛养菌无法通过常规的培养方法生长。近年来临床发现细菌“L”型[6]已成为慢性骨髓炎难以治愈的主要原因。L型细菌是细菌的细胞壁部分或全部缺失产生的变异菌，具有返祖化特征，但患者抵抗力下降或抗菌药物浓度下降时、可转化成金葡菌[7]。有文献报道若不开展厌氧菌培养或其他微生物检测，则大约有25．7%的病原菌不能被及时发现，特别是某些单纯厌氧菌感染，这种感染以往由于未做厌氧菌培养，需氧菌培养阴性而被误诊为无菌脓肿[8]。由于厌氧菌感染常为多菌性，不仅细菌协同现象值得注意，而且厌氧菌中最多见的脆弱杆菌能产生β内酰胺酶。其能显著减低病灶中的β－内酰胺类抗生素的浓度并将其灭活，因此在临床治疗时选用抗生素时要加以考虑。

表3主要G-病原菌对15种抗生素的敏感率[n（%）]

3.2 病原菌耐药性的分析

本次分离的G+菌对青霉素敏感率率仅5．8%，对骨髓炎已几乎无治疗作用。同时也检测到较高比例的MRSA．79．5%．对这种细菌所有的β内酰胺抗生素全部无效，因此G+菌感染时应尽量做好MRSA的检测。喹诺酮和林可霉素类还有较高的敏感率都在80%以上。有学者报道[9]皮下注射头孢噻吩和林可霉素2H后在兔骨中未检测带头孢噻吩，而检测到了林可霉素。据罗明琍等[10]报道克林霉素在骨骼组织中能达到较高的血药浓度，对于治疗非典型性的MRSA感染性骨髓炎患儿也有很好的疗效。而喹诺酮类药物对粘附细胞有效，可渗入巨噬细胞和多型核白细胞，骨浓度和给药剂量成正比，给予一个剂量后超过大多数病原菌的MIC即骨浓度＞1 μg/G，而且两药的副作用小，在临床应用中可以作为对G+菌感染的骨髓炎，喹诺酮和林可霉素是较理想的药物。本次检出的金葡菌有79．5%为MRSA，MRSA是对β－内酰胺类抗生素及其他多种抗生素高度、多重耐药的金葡菌，MRSE通过不同的机制对氨基糖苷类、大环内酯类、氯霉素和四环素等耐药，但是通常对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺及一些氟喹诺酮类敏感[11]。本次资料显示万古霉素和替考拉宁多具有最好的抗阳性菌活性，金葡菌敏感率100%溶血葡萄球菌敏感率98%。万古霉素和替考拉宁对G+的敏感率虽然很高，但临床应根据患者自身感染情况采取个体优化治疗方案，且使用时应密切监测患者的肝肾功能，防止产生严重的毒副作用。考虑到万古霉素的副反应，临床更多地采用局部使用。近年来一些携带抗生素的载体在骨髓炎的治疗中起到了临床效果，如载万古霉素硫酸钙等。据张展等报道[12]局部使用载万古霉素硫酸钙后。病灶局部引流液中万古霉素平均浓度136．56 mg/L，最高浓度845．61 mg/L、最低浓度37．55 mg/L。3例患者硫酸钙人工骨用量为2．5 mL，平均浓度为88．53 mg/L，最高浓度为758．84 mg/L，最低浓度为50．43 mg/L；1例患者硫酸钙人工骨用量为1．5 mL，平均浓度为93．20 mg/L，最高浓度127．36 mg/L最低浓度为35．42 mg/L均超过万古霉素的有效治疗浓度（15～20）mg/L和最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。因此针对G+病原菌感染的骨髓炎，局部使用万古霉素具有很好的应用前景。氨基糖甙类、红霉素、四环素都有较好的抗菌活性，但是这几类药物有效骨组织浓度小、副作用大等缺点，为克服这些缺点，临床上已经开发出携带这些抗生素的新材料，在局部使用治疗骨髓炎，取得了不错的疗效。Lee[13]等将庆大霉素与BMP顺序固化与钛表面，制得的GS/BMP－2Hep－Ti不仅能抑制金葡菌，同时大大加强碱性磷酸酶活性和成骨细胞的钙沉淀，具有优越的抗菌活性和促进成骨细胞增值的双重功能。在一定程度上起了缓释庆大霉素的作用，同时降低了药物的毒性。通过对表3的分析，头孢唑啉、头孢拉定对G－菌的敏感率都不超过35%，说明一、二代头孢菌素对G－病原菌抗菌作用已经较差，除非有明确的药敏试验显示敏感，一般不作为抗骨髓炎的抗菌药物。头孢曲松、头孢他啶仍有较好的抗菌活性，敏感率大部分＞75%。说明三、四代头孢菌素在抗G－菌感染时可以选用。需要注意的是在铜绿对头孢曲松的耐药率较高85%，是因为头孢曲松对铜绿的活性很弱，因此当怀疑是铜绿感染时应避免使用头孢曲松。哌拉西林的敏感率只有15%，但是添加了酶抑制剂他唑巴坦后其敏感性明显上升，说明G－阴性病原菌中有很多产ESBL的菌株。尤其对铜绿的敏感率达86%，因此针对铜绿引发的慢性骨髓炎哌拉西林/他巴唑是较理想的抗菌药物。亚胺培南对G－中仍有很强大的抗菌效果，敏感性为均在90%以上，还有很大的临床应用价值。

3.3 临床用药建议

慢性骨髓炎的致病菌菌株繁多，且很多有多种细菌感染的情况，因此尽量采取联合用药。一般在第一次清创后就可以根据临床经验用药，当病原菌培养及药敏结果出来后、应及时更换敏感药物，一般维持4～6周[14]。损伤部位常有疤痕形成或血管损伤，导致血液循环障碍，抗生素的全身应用很难在损伤部位达到有效的药物浓度，因此在骨髓炎的抗菌治疗中局部使用敏感药物也是可选择的方案。

慢性骨髓炎在临床上难于治疗的根本原因是病原菌持续感染，除了局部瘢痕增生、血供差、耐药菌等原因外，也是其难治的主要原因之一。细菌在死骨、内固定物、周围瘢痕组织等表面形成细菌生物膜（baterial biofilm，BBF），BBF是由细菌群体附着于有生命或无生命物体表面，分泌胞外大分子将自身包裹，具有特殊的内部生态环境和不同的细菌基因表达[15]。据钱燕儿等[16]报道生物膜阳性菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、利福平及庆大霉素的耐药性显著高于生物膜阴性菌株，生物膜阳性菌的MRSA阳性率高达66．7%，显著高于生物膜阴性株。

目前认为在清除病灶的基础上修复创面，同时合理应用抗菌药物是控制感染的主要手段。病原菌培养仍是诊断慢性骨髓炎的金标准之一，培养标本采集不规范或术前使用抗生素都会影响培养结果。

创面分泌物的培养对诊断来说是不够的，应该在手术中取出更多的标本进行培养，包括窦道分泌物、脓液、软组织及骨刮取物，尤其是骨组织及髓腔内分泌物的培养是十分必要的。临床微生物室应尽量扩大培养范围，开展厌氧菌、L型菌的培养及药敏，可降低漏检率，获得更多药敏结果。给骨科医生提供更准确、全面、及时的微生物学报告，使临床的治疗更加成功。

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Spectrum and susceptibility analysis of pathogens resulting in chronic osteomyelitis

XU Yubing1DING Fangping2
1.Department of Clinical Laboratory，Fuyang Orthopedics Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou, Fuyang311400,China；2.Department of Acupuncture and Moxibustion，Fuyang Orthopedics Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou City,Fuyang311400,China

Objective To understand the distribution and susceptibility of pathogens resulting in chronic osteomyelitis for guiding clinical rational use of antibiotics.Methods A total of 288 osteomyelitis secretions were cultured and sensitivity test were conducted.Results There were 283 cases of bacteria,including 123 cases of Gram-positive bacteria and 160 cases of Gram-negative bacteria after culture.Conclusion The top pathogen is Staphylococcus aureus,but the infection rate of Gram-negative bacteria is rising continuously until 53%,and is greater than that of Gram-positive bacteria.The susceptibility rates of Gram-positive bacteria to Quinolones,clindamycin were high and all of them were more than 80%.The susceptibility rates of Gram-negative bacteria to the first-generation and the second-generation cephalosporins are low and all of them are less than 35%.And susceptibility rates of Gram-negative bacteria to the third-generation,and the fourth-generation cephalosporins,quinolones,piperacillin/methimazole,imipenem are high.

Chronic osteomyelitis;Pathogens;Susceptibility

R446.5;R681.2

A

1673-9701（2015）27-0012-04

2015-04-28）

浙江省中医药科技计划基金（2014ZT005）