晏建新 王晓丽

1.贵州省人民医院药剂科，贵州贵阳550001；2.贵阳医学院药学院，贵州贵阳550004

金樱子鞣质提取率影响因素分析及提取条件优化

晏建新1，2王晓丽2▲

1.贵州省人民医院药剂科，贵州贵阳550001；2.贵阳医学院药学院，贵州贵阳550004

目的优化金樱子中鞣质的超声提取工艺。方法采用磷钼钨酸-紫外分光光度法测定鞣质含量，在单因素试验的基础上，选取液料比、超声提取时间和乙醇百分浓度作为自变量，金樱子鞣质提取率为因变量，对自变量各水平进行多元线性回归和二项式拟合，采用星点设计-响应面法选择最佳工艺条件，并进行预测分析。结果最佳工艺为：乙醇浓度75%，料液比1∶30，超声提取时间60 min，提取温度为50℃。结论优化的金樱子中鞣质超声波提取工艺简便可靠、稳定、提取率高，为金樱子中鞣质的开发利用奠定基础。

金樱子；鞣质；超声提取；响应面法

金樱子是蔷薇科植物金樱子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果实［1］，又名蜂糖罐，在我国大多数地方均有分布，特别是贵州省分布广，产量高［2］。金樱子药食同源［3］，具有补肾固精、止泻之功效。化学成分研究多为多糖类和黄酮类，对鞣质类研究较少。鞣质具有收敛性，内服可治胃肠道出血、水泻等症，被认为是良好的天然抗氧化剂［4］。鞣质是一类次生代谢产物，植物界广泛存在，近几年的研究表明鞣质具有较好的抗肿瘤活性［5］。

星点设计是在二水平析因设计的基础上，加中心点和星点组成，实验次数较少，对非线性拟合的实验设计较适宜，具有实验设计简单、试验次数少、精密度高的特点［6］。响应面法集数学和统计学方法于一体，是建模和多元变量最优化的一种统计方法［7］。对于中药有效成分的提取工艺研究，星点设计以及效应面优化法是重要的实验条件设计、优化方法之一，具有数据量大、预测性好、直观的优点，比正交和均匀设计更适用于探索性的试验研究。因此采用此方法研究金樱子中鞣质的超声提取工艺，为金樱子的合理开发利用提供一定的科学依据。

1 仪器与试药

超声清洗仪（上海超声设备有限公司，SK3300H型）；紫外分光光度计（津岛UV-2401型，日本）；分析天平（FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；HH-2恒温数显水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）；FZ102型粉碎机（天津市泰斯特仪器公司）。

没食子酸（中国药品生物制品检定所，批号为：110831-200302），其他所有试剂均为分析纯；水为重蒸水。按《中国药典》2010年版制订的方法配制磷钼钨酸试液。

金樱子，2013年10月采自贵州遵义县团溪镇，经贵阳医学院药学院王晓丽教授鉴定为蔷薇科植物金樱子的成熟果实。

2 方法与结果

2.1 鞣质的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品25 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取10 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀即得0.05 mg/mL没食子酸溶液。

2.1.2 标准曲线的制备精密量取对照品没食子酸溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL分别置于25 mL棕色量瓶中，分别加磷钼钨酸溶液1 mL，再分别加水11.5、11、9、8、7 mL，摇匀，用20%碳酸钠溶液稀释至刻度［8］，摇匀，放置30 min，以相应的试剂作空白实验，照紫外-可见分光光度法，在波长为760 nm处测定，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。其线性方程为Y=0.0609X-0.0056（r=0.9997），表明没食子酸在0.001～0.011 mg/mL与吸光度呈良好线性关系。

2.1.3 供试品溶液的制备金樱子去刺、去核毛，置60℃恒温箱中烘干，自然冷却后粉碎（过60目筛），精密称取粉末1 g，置250 mL棕色量瓶中，按照实验设计，分别精密加入不同百分浓度、不同体积的乙醇，密塞，称定其质量；超声波处理不同时间（超声功率100 W，控制水温在50℃以下［9-10］）后，取出称其质量，用相应浓度乙醇补足失掉的质量，摇匀，静置后滤过，精密量取续滤液5 mL，在25℃条件下，减压回收至不含乙醇为止，转移至25 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，静置后过滤，续滤液即供试品溶液［11］。

2.2 样品测定

鞣质含量测定［12］按照《中国药典》2010年版一部附录XB进行［1］。

2.2.1 总多酚含量的测定精密量取供试品溶液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入磷钼钨酸试液1 mL，加水10 mL，按“2.1.2”项下“然后用20%碳酸钠溶液稀释至刻度”起，测定其吸光度，利用线性方程计算供试品溶液总多酚含量。

2.2.2 不被吸附的多酚含量的测定精密称取干酪素0.6 g于100 mL具塞锥形瓶中，精密量取供试品溶液25 mL加入锥形瓶中，密塞，置于30℃的水浴中保温1 h，期间时时摇动，取出放冷，摇匀，过滤取续滤液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按“2.1.2”项下下“然后用20%碳酸钠溶液稀释至刻度”起测定吸光度；同时空白实验，不被吸附多酚的吸光度=供试品溶液中多酚的吸光度-空白溶液的吸光度，利用线性方程计算供试品溶液不被吸附的多酚含量。

2.2.3 鞣质含量的计算鞣质的含量=总多酚含量-不被吸附多酚含量，鞣质是可被干酪素吸附的多酚；鞣质提取率（%）=提取出的鞣质含量/药材中鞣质的含量×100%。

2.3 单因素试验考察

2.3.1 乙醇百分浓度称取干燥的金樱子粉末约1.0 g，共5份，精密称定，分别加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇30 mL于100 mL容量瓶中，超声时间为60 min后，按“2.2”项下来计算鞣质提取率分别为5.16%、5.57%、5.98%、5.97%、5.96%，故选取乙醇浓度70%。2.3.2液料比称取干燥的金樱子粉末约1.0 g，共5份，精密称定，分别加入40%的乙醇10、20、30、40、50 mL于100 mL容量瓶中，超声时间为60 min，按“2.2”项下计算鞣质提取率分别为4.29%、5.31%、5.76%、5.56%、5.58%，故选取液料比30∶1。

2.3.3 超声提取时间称取下干燥的金樱子粉末约1.0 g，共5份，精密称定，加入50%的乙醇30倍量于100 mL容量瓶中，分别超声提取30、40、50、60、70 min，按“2.2”项下计算鞣质提取率分别为4.22%、5.41%、5.58%、5.81%、5.67%，故选取提取时间60 min。

2.3.4 超声提取温度称取下干燥的金樱子粉末约1.0 g，共5份，精密称定，加入70%的乙醇30倍量于100 mL容量瓶中超声提取60 min，分别在提取温度30、40、50、60、70℃，按“2.2”项下计算鞣质提取率分别为4.22%、5.31%、5.45%、4.35%、3.67%，故选取超声提取温度为50℃。温度高于50℃时，鞣质易发生变质［9］，故采用冷凝水控制超声温度在50℃左右［10］。

2.4 响应面法优选

以单因素试验为基础，上述4个自变量对金樱子中鞣质提取效果的影响程度较大的有乙醇百分浓度、超声提取时间、液料比，因提取温度的温度范围较小，所以对鞣质提取率影响亦较小，所以通过CCD法对鞣质提取率影响较大的超声提取时间、乙醇百分浓度及液料比3个因素进行优选，以鞣质提取率为因变量，设计了分别用代码-α，-1、0、1、α（α=1.732）表示的三变量五水平实验，变量水平见表1，试验安排和结果见表2。

表1 金樱子中鞣质超声提取工艺优选试验变量水平

将表2中数据运用Design-Expert 7.0.0软件进行响应曲面分析，以鞣质提取率（Y）为响应值分别对各因素进行多元线性回归和二项式方程拟合，得多元线性回归为：Y=5.53+0.11A+0.27B+0.27C（r=0.7908），说明模型拟合度和预测性较差，即多元线性模型不适合；故重新采用二项式拟合，得二项式模型为：Y=5.84+ 0.11A+0.27B+0.27C+0.046AB+0.044AC+0.029BC-0.043A2-0.26B2-0.14C2（r=0.9797），表明二次回归方程拟合度以及可信度均较好。采用此模型进行分析和预测，其方差分析见表3。

表2 金樱子鞣质超声提取工艺优选试验安排和结果

表3 金樱子鞣质试验设计方差分析

由方差分析表3可见，该回归模型P＜0.0001，表明该模型差异有高度统计学意义，失拟项P= 0.1068＞0.05，表明失拟项差异无统计学意义，从而说明该模型能对金樱子鞣质提取率进行准确分析和预测。一次项B-料液比和C-超声提取时间：P＜0.0001，表明差异有高度统计学意义；A-乙醇百分浓度：P=0.0002＜0.01，表明差异有高度统计学意义；同理二项式B2和C2极其显著；A2具有显著性；交互项AB、BC和AC不显著；说明不同的提取工艺条件对金樱子鞣质提取率不是简单的线性关系。

根据所拟合的回归模型，作相应的响应曲面图，考察所拟合的响应曲面形状，分析乙醇百分浓度、料液比和超声提取时间对金樱子鞣质提取率的影响，其3D响应曲面图和等高线图，见图1～3。这3个图较直观地反映了乙醇百分浓度、料液比和超声提取时间对响应值鞣质提取率的交互影响，同时等高线的形状可反应交互效应的大小强弱，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形表示两因素交互作用显著。

运用Design-Expert 7.0.0软件对二项式回归模型进行预测分析，得最佳提取工艺为乙醇浓度71.02%，料液比1∶37.3，提取时间61.18 min，提取率预测的最大值6.19%。

图1 乙醇浓度和料液比的3D响应面图和等高线图

图2 料液比和提取时间的3D响应面图和等高线图

图3 提取时间和乙醇浓度的3D响应面图和等高线图

2.5验证实验

验证响应曲面法所得到的最优条件，检验得到的结果是否可靠，在最佳条件下分别提取了3次（考虑到实际操作的情况，将鞣质最佳提取条件修正为料液比1∶30、超声时间为60 min、乙醇浓度为75%），提取温度为50℃，结果金樱子鞣质平均提取率为6.10%，与预测值的偏差0.94%，偏差不大吻合较好，说明优选的提取超声工艺预测性良好。

3 讨论

3.1 提取方法的选择

超声提取现已应用于大部分植物化学成分的提取［13］，利用超声辐射产生的强烈扰动效应、空化效应等多种效应来增加物质分子运动速度、频率、溶剂的穿透力以及加速提取成分进入溶剂，这样就能避免高温对提取成分造成的影响。鞣质为结构复杂的多酚类化合物［14］，是一类热不稳定成分。因此本实验采用超声波提取金樱子中鞣质，节能省时，且能有效地提高金樱子鞣质的提取率。

3.2 单因素的考察

通过单因素与星点设计-响应面法相结合的试验方法，对金樱子中总鞣质的提取工艺进行了优选。因响应面优化的前提是所设计的实验点应包括较佳的实验条件，一旦实验点选取不当，就不能得到较好的优选结果。因此本实验在进行星点设计之前，对可能影响金樱子中鞣质提取率的各因素分别进行考察，确定了各个因素的较佳水平，并缩小了各因素的水平范围，这对于通过效应面法优选较佳提取工艺有利，也有利于预测结果的准确性。

基于Design-Expert 7.0.0试验设计软件，通过二次回归得到了金樱子鞣质提取率与乙醇百分浓度、液料比、超声提取时间的二次回归模型，经方差分析得出该回归模型是合理可靠的，能较好地预测金樱子鞣质提取率。再利用该模型的响应面及其等高线直观得出对影响金樱子鞣质提取率较大因素的相互作用，得到最优工艺为：乙醇百分浓度为75%，超声提取时间为60 min，液料比为1∶30，超声提取温度为50℃。因此，利用星点设计-响应曲面法对金樱子鞣质超声提取工艺进行优选，能获得最优的工艺条件，这样能有效减少工艺操作的盲目性，简单易行、省时节能且提取效率高，为金樱子鞣质的开发利用提供实验依据，对其他类药材中鞣质的提取有着一定的参考依据。

［1］国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：206，附录62，附属XB.

［2］刘众，高智席，李丽，等.金樱子中芦丁和槲皮素不同提取方法的比较研究［J］.安徽农业科学，2011，39（8）：4521-4522.

［3］刘学贵，李佳骆，高品一，等.药食两用金樱子的研究进展［J］.食品科学，2013，34（11）：392-398.

［4］郑荣梁，黄中洋.自由基生物学［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［5］Sharif T，Auger C，Alhosin M，et al.Red wine polyphenols cause growth inhibition and apoptosis in acute lymphoblastic leukaemia cells by inducing a redox-sensitive up-regulation of p73 and down-regulation of UHRFl［J］. Eur J Cancer，2010，46（5）：983-994.

［6］Kleijnen JPC，Hertog D，Angun E，et al.Response surface method-ology'S steepest ascent and stepsize revisited Crrection［J］.Eur J Operational Res，2006，17（1）：664.

［7］韩伟，刘傲霞，成悦，等.星点设计—效应面优化法在中药提取中的应用［J］.机电信息，2013，26（9）：1-5.

［8］王添敏，孙晓丽，彭雪，等.胡桃楸的根、茎枝、叶和果皮中总鞣质的含量测定［J］.中国中药杂志，2011，36（1）：32-36.

［9］俞文婕，王添敏，翟延君，等.星点设计-效应面法优化胡桃楸茎枝中总鞣质提取工艺［J］.中成药，2013，35（7）：1419-1424.

［10］陈毅挺，林明峰，郑水钦，等.翻白草中鞣质的超声提取工艺研究［J］.闽江学院学报，2010，31（2）：107-110.

［11］林芳花，彭永宏，沈翠霞，等.金樱子鞣质含量测定及其抗氧化提高生育力的实验研究［J］.中国野生植物资源，2012，31（4）：15-17.

［12］王坤，鲁静.中药材中鞣质含量测定方法的研究［J］.中国药事，2004，18（6）：361-364.

［13］薛峰，李春娜，李明收，等.超声提取在中药化学成分提取中的应用［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（18）：231-234.

［14］张爱武，刘乐乐，罗素琴，等.正交试验优选蒙药狗尾草果实中总鞣质的提取工艺研究［J］.内蒙古医科大学学报，2013，35（3）：216-218.

Analysis of influence factors on extraction rate of tannin from Rosa Lae鄄vigatae Fructus and optimization of extraction condition

YAN Jianxin1，2WANG Xiaoli2▲
1.Department of Pharmacy,Guizhou People's Hospital,Guizhou Province,Guiyang550001,China;2.College of Pharmacy,Guiyang Medical University,Guizhou Province,Guiyang550004,China

ObjectiveTo optimize the process of ultrasonic extracting effective constituents from Rosa Laevigatae Fructus of tannin.MethodsThe content of tannin was determined by phosphomolybdotungsitc acid-UV spectmphotometry solvent.Based on single-factor tests,with ethanol percent,solid-liquid ratio,extraction time as independent variables and yield of tannin from Rosa Laevigatae Fructus as dependent variable,multiple linear regression and binomial fitting was adopted by central composite design model,and determine optimum extraction technology,and the forcast analysis was done.ResultsThe best extraction process was as followed:the concentration ethanol of 75%,ratio of solid-liquid of 1∶30,extraction time of 60 min,extraction temperature of 50℃.ConclusionThis optimized extraction process is simple and reliable,it can laid a certain foundation for development and utilization of tannins from Rosa Laevigatae Fructus.

Rosa Laevigatae Fructus;Tannin;Ultrasonic extraction;Response surface method

R284.2

A

1673-7210（2015)02（b)-0099-04

2014-11-14本文编辑：卫轲）

贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（编号：黔科合ZY字［2012］3004）。

▲通讯作者