吴栋杰

(广西柳州市人民医院皮肤性病科 545001)

论著·基础研究

308 nm激光联合胡椒碱促进毛囊外根鞘无色素黑色素细胞黑色素合成

吴栋杰

(广西柳州市人民医院皮肤性病科 545001)

目的 研究308 nm激光联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑色素细胞(AMMC)黑色素合成及TRP-1、TRP-2 蛋白表达的影响。方法体外培养的AMMC分为联合疗法组、308 nm准分子激光组、胡椒碱组、阳性对照组及空白对照组，作用24、72、120 h，测定黑色素水平，激光共聚焦显微镜观察并定量分析细胞内酪氨酸酶相关蛋白酶TRP-1、TRP-2的表达情况。结果联合治疗组、308 nm准分子激光组、胡椒碱组、阳性对照组均不同程度地促进黑色素合成，其中以联合治疗组促进作用最强。联合治疗组和胡椒碱组的0.5 mmol/L胡椒碱在72 h内对黑色素水平促进作用最明显。对于TRP-1的表达，浓度为0.5 mmol/L的胡椒碱即可以对其产生促进作用，但对TRP-2生成无促进作用。308 nm准分子激光对TRP-1、TRP-2生成均有促进作用。结论308 nm准分子激光联合胡椒碱能促进AMMC细胞的黑色素合成。

308 nm激光；胡椒碱；黑素细胞，无色素；毛囊外根鞘；黑色素合成

本研究前期实验对小鼠B16黑色素瘤细胞黑色素合成研究中，应用308 nm激光结合胡椒碱对其作用进行分析，发现两者结果具有较强的促黑色素合成作用。本文继续深入研究联合治疗对毛囊外根鞘无色素黑色素细胞(AMMC)黑色素合成及TRP-1、TRP-2 蛋白表达的影响，并对其中可能的作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器 美国Gibco公司生产的RPMI 1640培养基、美国Sigma公司生产的胰蛋白酶和二甲基亚砜(DMSO)、杭州四季青生物材料有限公司生产的新小牛血清以及美国Amersco公司生产的脱氧胆酸钠，剩余试剂则全部都是分析纯。美国Sigma公司的左旋多巴(DL-Dopa)以及蘑菇酪氨酸酶；美国Corning公司生产的96孔培养板、澳大利亚Clinibio公司生产的Clinibio 128C酶联免疫检测仪以及上海精密分析仪器有限公司生产的722分光光度计。DL-Dopa采用三蒸水将其进行配置成溶液2.5 mL，蘑菇酪氨酸酶则被制成25 IU/mL。在患者治疗中，所选用的则为美国Photomedex公司生产的Xtrac巅峰准分子激光系统，其波长为305 nm，借助于氯化氙气体进行工作。

1.1.2 药品 将中国药品生物检验提供的胡椒碱配备成原液，其浓度为20 mg/mL，并将其放置在-20 ℃保存。在临时使用中，可以采用培养液调整浓度，根据既往研究将胡椒碱的最终浓度分别确定为1.0、0.5、0.1 mmol/L[1]。江苏潥阳制药厂生产的8-甲氧补骨脂素作为阳性对照药，将其采用DMSO溶解。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 AMMC放置在RPMI 1640培养基中进行常规培养，其中培养基中含有10%小牛血清、100 μg/ mL链霉素以及100 U/mL青霉素，其培养条件为37 ℃、5% CO2，细胞生长达到95%融合时，0.25%胰蛋白酶进行消化，采用椎虫蓝染色体法进行活细胞计数，并在250 mL玻璃培养瓶中进行接种，接种密度1×104/cm2。接种24 h后，即可以采用含有药物的新鲜培养基，对其再次进行72 h孵育，收获、计数细胞，将其均分成两份，进行黑色素水平测定和激光共聚焦荧光定量分析。为了降低培养基中其他成分对结果的影响，采用不含小牛血清的DMEM基础培养基在实施实验之前，将进行一次换液。

1.2.2 实验分组 将其分成5组，第1组为联合疗法组，照射能量为300 mJ/cm2的308 nm激光，根据作者此前的研究结果设定照射时间为7 s，并结合胡椒碱，其浓度分别为1.0、0.5、0.1 mmol/L；第2组为308 nm准分子激光组，单纯能量照射，方法同联合疗法组；第3组则为胡椒碱组，单纯使用胡椒碱，方法同联合疗法组；第4组为阳性对照组，采用308 nm准分子激光结合8-甲氧补骨脂素(0.1 mmol/L)；第5组则为空白对照组，单纯加入溶媒介质。

1.2.3 黑色素水平测定 依照Ando等[2]方法对黑色素水平进行测定实施改良，在细胞收获之后，细胞计术采用血细胞计数器对其进行4次测量取平均数，PBS清洗2次，加入双蒸水200 μL悬浮细胞，再加入1∶1的乙醇和乙醚1 mL混合液，室温下放置15 min，采用3 000 r/min转速进行5 min离心，经过沉淀之后，在其中加入1 mL的1 mol/L NaOH(其中含有10% DMSO)，再将其在80 ℃条件下放置30 min，进行黑色素溶解，在NaOH中添加4 mL双蒸水进行稀释(浓度为0.2 mol/L)。采用分光光度计进行测量，黑色素水平的计算方法：(药物处理组A475/细胞数)/(空白对照组A475/细胞数)×100。各个实验重复4次。

1.2.4 激光共聚焦荧光定量分析 按照文献[3]的方法,对其实施荧光定量分析以及激光共聚焦显微镜观察。将各组细胞种植于盖玻片上3、5、7 d，PBS清洗3次，每次5 min，在室温中4%多聚甲醛液固定，养血清封闭细胞10 min，随后吸掉。加入一抗溶液：兔抗人TRP2抗体(1∶150)、兔抗人TRP1抗体(1∶150)以及兔抗人酪氨酸酶抗体(1∶150)，37 ℃下孵育60 min。PBS冲洗3次，每次5 min，加入FITC标记的山羊抗兔IgG二抗溶液(1∶100)，37 ℃孵育30 min。PBS缓冲液冲洗盖玻片3次，滤纸吸掉PBS缓冲液，在待测样品中分别加入0.2 mL PBS，激光共聚焦显微镜进行观察和分析，激发光波长选择488 mm。

2 结 果

2.1 308 nm准分子激光及胡椒碱的影响作用 传代培养的AMMC形状是纺锤形。在通过胡椒碱和308 nm准分子激光照射之后，其细胞出现细胞体增大，树状突起增加和延长,见图1。

A:传代培养的AMMC；B:308 nm准分子激光联合胡椒碱处理的AMMC。

图1 308 nm EL联合胡椒碱对AMMC细胞形态的影响(激光共聚焦显微镜×100)

2.2 不同组对AMMC活性和黑素合成的影响 胡椒碱能够对黑素水平的增加产生促进作用，作用最明显的是在72 h，使用0.5 mmol/L胡椒碱的联合治疗组、胡椒碱组与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。对比分析0.1 mmol/L 8-甲氧补骨脂素作用120 h和0.5 mmol/L胡椒碱作用72 h，其黑素量的增加显著(t=3.50,P<0.05)。见表1。

表1 各组AMMC黑色素水平

a：P<0.05，b：P<0.01，与空白对照组同时间点比较；c：P<0.05，与阳性对照组同时间点比较；-：此项无数据。

表2 0.5 mmol/L胡椒碱作用72 h后对AMMC黑素合成相关酶的影响

2.3 不同观察组对AMMC TRP-1、TRP-2蛋白表达的影响 和空白对照组比较，胡椒碱组黑色素细胞TRP-1的表达量明显增高(t=6.34,P<0.01);TRP-2的表达量与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。308 nm准分子激光组对TRP-1、TRP-2均有促进作用，较空白对照组高(t=10.64,P<0.01;t=9.32,P<0.01)。见表2。

3 讨 论

在临床上，白癜风是一种非常常见的皮肤色素脱失性疾病，对患者的容貌具有严重影响。虽然临床中不断出现新的治疗方法，但是其治疗效果依然不尽如人意，因此需要进一步对其临床治疗方法和理论进行完善。其中白癜风的发病重点是黑色素细胞(MC)的缺失。MC发育学研究已证实：位于毛囊外根鞘的AMMC是表皮MC的主要来源-储库，在多种因素作用下，休眠状态AMMC被活化，经过黏附等一系列环节迁移到表皮并进一步增殖、活化，完成表皮着色过程[4]。这一过程也同样存在于白癜风复色中。临床现象也支持上述观点。白癜风白斑的复色开始是从毛囊口，在其周围一开始有色素性皮岛的形成，继而逐渐扩大。因此促进AMMC的活化、黏附对增加白癜风皮损区MC的数量和功能极为关键。在白癜风临床治疗中，308 nm准分子激光是新出现的一种治疗手段，其光源的组成则主要是氯原子和疝原子形成的二聚体，之后将中波紫外线波长范围[5]的脉冲气体激光连续发出。目前308 nm准分子激光在临床治疗中的良好效果已经得到国内外临床的统一公认[6-7]。但是关于其治疗作用机制，临床研究还集中在其对T细胞凋亡的促进作用以及其对角质形成细胞产生的MC抑制的干预作用方面，另外对于其能够对AMMC产生直接影响也具有研究，但是关于黑色素生成的促进作用研究不广泛。

MC合成黑色素过程复杂，在其合成过程中酪氨酸酶占有重要地位，在上调生物合成过程中，很多药物可通对这种限速酶的分子结构实施翻译后的重修饰，以加强其生物学活性，促进其作用的发挥[8-10]。在络氨酸酶基因中TRP-1以及TRP-2共同属于是其超家族成员，其对于黑色素化合过程的后续步骤具有催化作用，其和络氨酸酶在黑色素细胞中的存在形式则为多酶复合体，并且其复合体具有一定的稳定作用。其中TRP-1的催化作用比较弱，经过研究只有在含有黑色素的细胞中，才会有TRP-1 mRNA的存在，因此也就能够说明在优黑色素生成过程中，TRP-1具有重要作用[11]。TRP-2则是在多巴色素转变为5、6-二羟基吲哚-2-羧酸(DHICA)起催化作用,控制着DHICA/DHI的比例,具有加速黑色素生成作用。激光共聚焦定量分析荧光染色后的AMMC细胞TRP-1和TRP-2的表达发现胡椒碱作用后TRP-1的表达量较空白对照高(P<0.01)，而TRP-2的表达量与空白对照组无差异(P>0.05)，这与马慧军等[12]、方俊杰等[13]的结论一致。提示胡椒碱的促表皮MC黑色素合成的作用可能通过上调TRP-1的表达发挥作用而与TRP-2无明显关系。因为TRP-1和优黑色素生成关系较为密切，因此我们也就能够预测胡椒碱对于MC中的优黑色素合成具有促进作用[14]。另外，观察结果显示，308 nm准分子激光对TRP-1、TRP-2均有促进作用，对黑色素合成有明显促进作用。

研究结果表明，308 nm准分子激光联合胡椒碱对AMMC黑色素合成及TRP-1、TRP-2 蛋白表达的促进作用较空白对照组有明显增加。本次研究为白癜风的临床治疗提供新的方法，同时还确定了联合胡椒碱促进308 nm准分子激光黑色素的生成作用以及其对AMMC的直接活化作用，为以后的研究提供了条件。

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308 nm excimer laser combined with piperine activated the production of melanin in amelanotic melanocytes in outer root sheath of hair

WuDongjie

(DepartmentofSkinVenereal,People′sHospitalofLiuzhouCity,Liuzhou,Guangxi545001,China)

Objective To study the mechanism of 308 nm excimer laser combined with piperine activated the production of melanin in amelanotic melanocytes in outer root sheath of hair(AMMC),and promote the expression of TRP-1、TRP-2 protein.Methods AMMC were in incubated for 24、72、120 h in different groups(combination therapy group,the 308 nm excimer laser group,the piperine group,the positive control group and the control group).Then the melanin content was measured.The expression change of TRP-1 and TRP-2 in cells were observed by laser scanning confocal microscopy.Results Four groups increased the AMMC cellular melanin content.Four different groups could promote melanin content at different degrees.The combination therapy group played the strongest role in promoting function.And the function was the most obviously in 24 h,it also was concentration dependent.0.5 mmol/L piperine in combination group and piperine group could produce promoting effect of within 72 h on the expression of TRP-1,but its role was not evident in the expression of TRP-2.308 nm excimer laser had effects both on TRP 1 and TRP 2.Conclusion 308 nm excimer laser combination with piperine can increase the activation of amelanotic melanocytes in outer root sheath of hair.

308 nm laser;piperine;melanocyte,amelanotic;outer root sheath of hair;melanogenesis

吴栋杰(1980-)，主治医师，本科，主要从事皮肤性病研究。

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.18.008

R739.5

A

1671-8348(2015)18-2471-03

2015-01-11

2015-03-16)