黄友如 齐 斌 王立梅 陈义勇 朱益波 崔竹梅

（常熟理工学院生物与食品工程学院，苏州 215500）

重水环境下的氧化大豆蛋白Raman光谱分析

黄友如 齐 斌 王立梅 陈义勇 朱益波 崔竹梅

（常熟理工学院生物与食品工程学院，苏州 215500）

应用Raman光谱分析了不同亚油酸浓度下脂肪氧合酶催化诱导产生的大豆蛋白聚集体的结构变化。结果表明，当模拟反应体系中亚油酸浓度在3.14～6.09 mmol／L范围之间时，拉曼光谱中归属于CH和CH2弯曲振动的谱带强度增强，而归属于位于非极性环境中的色氨酸和酪氨酸残基的谱带强度减弱；当亚油酸浓度达到7.51 mmol／L时，则出现相反的结果，这表明大豆蛋白质的聚集涉及到疏水相互作用。此外，在蛋白质拉曼光谱中还观察到胱氨酸残基二硫键的伸缩振动变化。二级结构分析表明反应后大豆蛋白α-螺旋减少，β-折叠增加。

大豆蛋白 脂肪氧合酶 亚油酸 氧化性修饰 Raman

通过建立由脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）、亚油酸（linoleic acid，LA）和低脂质含量大豆蛋白（lipid-reduced soy proteins，LRSP）组成的三元模拟体系，结合傅里叶变换红外黄友如等［1］研究了不同亚油酸浓度下脂肪氧合酶催化诱导产生的大豆蛋白聚集体的部分结构变化。与红外光谱一样，Raman光谱也是振动光谱，它们是研究分子间能级跃迁的两种互补方法。有些分子能级跃迁只具有红外活性，而另一些只具有Raman活性，还有一些跃迁既有红外活性，又具有Raman活性。红外光谱主要反映的是分子振动中偶极距的变化，而Raman光谱则主要体现了分子极化率的变化情况，二者反映了蛋白质和多肽中不同侧面的信息。利用蛋白质的Raman光谱可以得到有关其氨基酸组成、二级结构、主链构象、侧链构象、电离化基团和化学键的构象、残基内氢键变化方面的信息［2］。这些信息的获得使得对大豆蛋白完整结构的分析有了可能，保证观察到的结构特征反映的是大豆蛋白的真实状态。

本试验应用Raman光谱进一步对大豆蛋白聚集体在不同状态下的微区结构和二级结构进行测定分析，研究不同LA浓度下LOX诱导聚集过程中蛋白质构象的变化，揭示大豆蛋白聚集体形成的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

低温脱脂豆粕：山东禹王实业有限公司植物油厂；脂肪氧合酶（LOX I-B，70 800 U／mg）：Sigma公司；亚油酸（色谱纯，含量≥99.0%）：Sigma公司；重水（重氢含量：99.8%，pD6.8）：北京化工厂；其他试剂均为分析纯；LabRam-1B型显微拉曼光谱仪：法国Dilor公司。

低脂质含量大豆蛋白（lipid-reduced soy proteins，LRSP）：自制［1］。

1.2 用于结构分析的样品制备

底物LA溶液和LOX酶液：自制［1］。将LRSP溶于去离子水中配制成5%的大豆蛋白溶液，用1.0 mol／L NaOH调 pH 9.0。

模拟反应体系由LOX、LA和LRSP组成（表1），将其反应体系放入30℃的水浴中分别恒温振荡培养6.0 h后取出，冰浴冷却至0℃后用1.0 mol／L HCl调 pH值至 4.5酸沉，离心（11 000r／min，30 min）取沉淀水洗，水洗后的蛋白沉淀分散于去离子水中并用1.0 mol／L NaOH调pH值至7.0。所得蛋白（Reacted soybean proteins，RSP）溶液分别冷冻干燥后粉碎并过80目标准筛。

表1 模拟反应体系的组成

1.3 Raman光谱测定

样品处理：将蛋白样品分散在重水中配制成100 mg／mL的溶液，分析前在5℃下贮藏48 h，以使H／D能够完全置换。试验条件：法国Dilor公司LabRam-1B型显微拉曼光谱仪，He-Ne激光器，波长为632.8 nm，功率6.4 mW，积分时间100 s，室温下测定。

2 结果与分析

2.1 巯基和二硫键的分析

在聚集体形成过程中可能发生二硫键的形成与交换，前面在聚集体的巯基和二硫键含量的测定中采用了间接化学分析的方法，结果发现，与对照样品相比较，在大豆蛋白制备的模拟体系中，同时添加LA和LOX制备的大豆蛋白，其游离巯基和总的巯基与二硫键的含量都下降了［3］。

在蛋白质拉曼光谱中，500～550 cm-1区域的峰通常与二硫键C—C—S—S—C—C结构单元的S—S伸缩振动模式有关［4-5］。这里拉曼光谱的直接分析清晰地表明（图1，表2），反应后大豆蛋白在二硫键和S-S伸缩振动区域（500～535 cm-1）均发生了变化。对照样品RSP1的谱峰位于525 cm-1，其相对强度仅为0.07，相比之下，RSP2和RSP3的谱峰发生了位移，分别在516 cm-1和536 cm-1各出现一个峰，且相对强度随反应程度的增加而增加。这种位移说明聚集体中二硫键构象已由对照样品的全旁-旁-反式构象（gauche-gauche-trans）转为旁式（gauche）与反-旁-反式（RSP2和RSP3）并存的构象。表明此类蛋白质胱氨酸残基周围的构象已发生了变化，同时也说明RSP2和RSP3聚集体的形成与二硫键的交联分不开。其外，发生在750 cm-1的半胱氨酸残基C-S振动谱峰的变化也可说明这一点，与对照样品相比，RSP2和RSP3在750 cm-1处的谱峰强度降低，说明反应后样品中的半胱氨酸（即游离巯基）含量减少。

图1 LOX催化的LA氧化对大豆蛋白拉曼光谱的影响

同样RSP4和RSP5的谱峰也发生了位移，其中心位于516 cm-1，相对强度随反应程度的增加而减少；另外RSP5样品在490 cm-1和534 cm-1各出现一个相对强度较低的额外峰。这种位移说明RSP4和RSP5聚集体中二硫键构象已由对照样品的全旁-旁-反式构象（gauche-gauche-trans）转为全旁式构象（gauche，RSP4）或旁式（gauche）与反 -旁 -反式（trans-gauche-trans，RSP5）并存的构象。这表明此类蛋白质胱氨酸残基周围的构象已发生了变化，同时也说明RSP4和RSP5聚集体的形成也涉及二硫键的交联，但随着反应程度的增加，样品中二硫键的含量在减少。至于游离巯基的变化从750 cm-1的半胱氨酸残基C-S振动谱峰的变化可看出，与对照样品相比，RSP4和RSP5聚集体在750 cm-1处的谱峰消失，说明反应后该样品中的半胱氨酸（即游离巯基）残基几乎没有了。结合前面的化学分析可知［3］，二硫键含量的减少与游离巯基的消失可能是巯基基团的进一步氧化造成的。

虽然二硫键的形成并不规定多肽链的折叠，然而一旦蛋白质采取了它的三维结构则二硫键的形成将对此构象起稳定作用［2］。反应后大豆蛋白巯基与二硫键含量的变化，反映了大豆蛋白聚集体的形成与蛋白质的氧化程度密切相关。

2.2 芳族氨基酸的分析

试验发现，反应后的样品其芳族氨基酸残基暴露的程度发生了变化，这表明聚集体的形成涉及疏水相互作用。表3为重水溶液中大豆蛋白芳族氨基酸的Raman谱峰峰位、相对强度及谱峰指认。在751、880、1 555和1 581 cm-1附近的峰是由于色氨酸吲哚环振动引起；与对照样品 RSP1相比，RSP2、RSP3和RSP4对应的峰强度减弱，它表明此类样品中的色氨酸残基在反应后较多地暴露出来。在1 333～1 378 cm-1之间的两个色氨酸峰，除了1 344 cm-1峰强度没有发生变化外，另一个1 363cm-1附近峰的强度在反应后的样品中同样减弱了，结果使得两峰之间的波谷变深；这再次证明样品RSP2、RSP3和RSP4中色氨酸周围的疏水环境变弱了（1 363 cm-1峰强则Trp趋向于埋藏，弱则暴露［8］）。酪氨酸残基也有类似的变化，与对照样品相比，RSP2和RSP4样品在643、830、853、1 208和1 326 cm-1的几个酪氨酸特征峰的强度均减弱了；不同的是，样品RSP3酪氨酸特征峰的强度反而增强了。酪氨酸峰在850和830 cm-1处的强度之比值（I850／I830），对氢键的性质或酚羟基离子化的状态十分敏感，它已被用来鉴定酪氨酸组分埋藏和暴露的程度［9］。与对照样品RSP1相比（0.76），RSP2、RSP3和RSP4的酪氨酸峰在850和830 cm-1处的强度之比值（I850／I830）均都增加了（RSP2、0.81；RSP3，0.77；RSP4，0.89）；这表明维持蛋白质三级结构的氢键受到了破坏，原来埋藏在蛋白质分子内部的酪氨酸氨基酸残基暴露于分子的表面，并作为氢键的供体或受体与水相互作用［8，10-12］。氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的作用［2］。通常大多数蛋白质所采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如α-螺旋，β-折叠片），与此同时保持大多数能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面将与水相互作用。RSP2、RSP3和RSP4氢键的变化反映此类蛋白质的三维结构发生了变化；疏水基团的暴露使得蛋白质的表面疏水性增强了。

表2 重水溶液中大豆蛋白巯基和二硫键的Raman谱峰峰位、相对强度及谱峰指认

表3 重水溶液中大豆蛋白芳族氨基酸的Raman谱峰峰位、相对强度及谱峰指认

与对照样品 RSP1相比，RSP5样品在574和1 582 cm-1两个峰的强度较大，表明反应后样品中的色氨酸残基大多埋藏在蛋白质分子的内部或者说色氨酸周围的疏水环境增强了。值得注意的是色氨酸的其他特征峰的强度（如751，880，1 344，1 362和1 555 cm-1）几乎没有变化，甚至减弱了。酪氨酸残基也有类似的变化，与对照样品相比，RSP5样品在1 206和1 327 cm-1处的峰强度增强，而在643、831和853 cm-1处的峰强度却减弱了。此外，与RSP1相比（0.76），在LA和LOX共同存在的反应情况下，RSP5（0.65）的酪氨酸峰在850和830 cm-1处的强度之比值（I850／I830）降低了；这表明由于 LOX诱导的LA氧化产物与大豆蛋白的相互作用增强，会导致蛋白质的疏水性残基进一步埋藏在分子的内部，蛋白质的表面疏水性降低。

疏水相互作用还涉及到脂族氨基酸的疏水基团，与对照样品相比，RSP2、RSP3和RSP5在1 316和1 450 cm-1附近的峰强度略有增加（表4），前者为CH弯曲振动，后者为CH2与CH3弯曲振动。不同的是RSP4样品在该区域的峰强度均明显降低了（表4）。这些结果表明，由LOX诱导氧化LA和大豆蛋白反应的结果促进了芳族和脂族氨基酸残基的相互作用，促使反应后的大豆蛋白通过疏水相互作用产生聚集。

2.3 二级结构的分析

以上是对蛋白质侧链基团振动模式的指认，下面将着力讨论酰胺带的变化，考察LOX催化的LA氧化对大豆蛋白质二级结构的影响。

表5为溶于重水溶液的大豆蛋白拉曼光谱酰胺III′的谱峰峰位、相对强度及谱峰指认。相比之下，大豆蛋白拉曼光谱的酰胺I′较弱，没有酰胺III′那么显著，因此这里仅讨论酰胺III′。

与对照样品RSP1相比，在1 050～1 082 cm-1之间对构象敏感的代表C—C，═C O和C—N骨架振动的各峰强度降低了，说明反应后的大豆蛋白，其结构已发生了改变。RSP2在935和947 cm-1附近的酰胺III′的强度没有变化，RSP4和5在935和947 cm-1附近的酰胺III′的强度都明显减少了，表明此类大豆蛋白的α-螺旋结构在反应后减少了。不同的是，RSP3样品在935和947 cm-1附近的酰胺III′带的强度却略有增加。与此同时，归属于典型β-折叠结构的酰胺III′带990 cm-1附近峰的强度明显增加（RSP2除外）。这些结果说明大豆蛋白与LA的相互作用可能是由于LOX诱导产生的自由基攻击，破坏了大豆蛋白相邻螺圈之间形成的氢键，导致α-螺旋的展开以及随后的分子相互作用，从而产生较多的β-折叠结构。

表4 重水溶液中大豆蛋白Raman光谱C-H弯曲振动区域的谱峰峰位、相对强度及谱峰指认

表5 重水溶液中大豆蛋白Raman光谱C-C和C-N、酰胺III′带等的谱峰峰位、相对强度及谱峰指认

3 结论

本研究应用Raman光谱对大豆蛋白聚集体在不同状态下的微区结构和二级结构进行了测定分析，结果表明，无论是溶液中的蛋白质抑或是LOX催化LA氧化与蛋白质相互作用所形成的聚集体，拉曼光谱均给出许多有价值和详细的信息，包括与疏水相互作用有关的芳族和脂族氨基酸侧链的暴露程度、二硫键的变化以及蛋白质的二级结构信息等。基于拉曼光谱的分析，可知由LOX催化LA氧化所诱导的大豆蛋白聚集行为包括疏水相互作用、氢键、二级结构的改变以及对反应后蛋白质构象稳定性有贡献作用的二硫键变化。

［1］黄友如，华欲飞，张根华，等.重水环境下的氧化大豆蛋白傅里叶变换红外（FT-IR）分析［J］.中国粮油学报，2010，25（5）：19-23，29

［2］陶慰孙，李惟，姜涌明.蛋白质分子基础［M］.第二版.北京：高等教育出版社，1995：247-254，260-263

［3］黄友如，华欲飞，裘爱泳.脂质氧化诱导的大豆蛋白质聚集机理的研究［J］.中国粮油学报.2006，21（1）：80-87

［4］Yu N T，Liu C S.Laser raman spectra of native and denatured insulin in the solid state［J］.Journal of the American Chemical Society，1972，94（9）：3250-3251

［5］Tu A T.Raman spectroscopy in biology：principles＆applications［M］.New York：John Wiley＆Sons，Inc.，1982：91-96

［6］Liu C S，Culver J，O’Shea D C.A preliminary raman spectroscopic study of native zinc-insulin crystals［J］.Biochimica Biophysica Acta，1972，263（1）：1-6

［7］Miura T，Satoh T，Takeuchi H.Role of metal-ligand coordination in the folding pathway of zinc finger peptides［J］.Biochimica Biophysica Acta，1998，1384（1）：171-179

［8］Howell N，Li-Chan E.Elucidation of interactions of lysozyme with whey proteins by ramanspectroscopy［J］.International Journal of Food Science and Technology，1996，31（5）：439-451

［9］Carey P R.Biochemical applications of raman and resonance ramanspectroscopies［M］.New York：Academic Press，1982：71-98

［10］Parker F S.Applications of infrared，raman and resonance spectroscopy in biochemistry［M］.New York：Plenum Press，1983：1-39，83-154，451-480

［11］Ogawa M，Nakamura S，An H，et al.Raman spectroscopy study of changes in fish actomyosin during setting［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47（8）：3309-3318

［12］Careche M，Li-Chan E Y C.Structural changes in cod myosin after modification with formaldehyde or frozen storage［J］.Journal of Food Science，1997，62（4）：717-723

［13］Overman SA，Thomas G J.Amide modes of theα-helix：Raman spectroscopy of filamentous virus fd containing peptide13C and2H labels in coat protein subunits［J］.Biochemistry，1998，37（16）：5654-5665

［14］Brunner H，Holz M.Raman studies of conformation of the basic pancreatic trypsin inhibitor［J］.Biochimica Biophysica Acta，1975，379（2）：408-417

［15］Aubrey K L，Thomas G J.Raman spectroscopy of filamentous bacterlophage Ff（fd，M13，fl）incorporating specifically-deuterated alanine and tryptophan side chains.Assignments and structural interpretation［J］.Biophysical Journal，1991，60（6）：1337-1349

［16］Cavatorta F，Fontana M P，Vecli A.Raman spectroscopy of protein-water interactions in aqueous solutions［J］.The Journal of Chemical Physics，1976，65（9）：3635-3640

［17］Overman SA，Thomas GJ.Raman spectroscopy of the filamentous virus Ff（fd，fl，M13）：structural interpretation for coat protein aromatics［J］.Biochemistry，1995，34（16）：5400-5451

［18］Yu N T.Raman spectroscopy：A conformational probe in biochemistry［J］.CRC Critical Reviews in Biochemistry，1977，4（3）：229-280

［19］Chen M，Lord R G，Mendelsohn R.Laser-excitedraman spectroscopy of biomolecules.IV.Thermal denaturation of aqueous lysozyme［J］.Biochimica Biophysica Acta，1973，328（2）：252-260.

Raman Spectroscopy Analysis of Oxidative Soybean Proteins in D2O

Huang Youru Qi Bin Wang Limei Chen Yiyong Zhu Yibo Cui Zhumei
（School of Biological Science and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Suzhou 215500）

The molecular structure of soybean protein aggregates formed with different linoleic acid concentration catalyzed by lipoxygenase have been examined by Raman spectral analysis.When the linoleic acid concentration in model system between 3.14 and 6.09 mmol／L，reacted soybean proteins had an involvement of hydrophobic interactions by intensification of spectral bands assigned to CH＆CH2 bending vibrations and decreased in the intensity of bands assigned to tryptophan and tyrosine residued in a nonpolar environment.When the linoleic acid concentration reached 7.51 mmol／L，the contrary results could be observed in the model system.Changes in the disulphide stretching vibrations of cystine residues also have been observed by Raman spectral analysis.Secondary structure analysis demonstrated that the interacting with linoleic acid catalyzed by lipoxygenase resulted in a decreased proportion of α-helix structures and increased proportion ofβ-sheet structures.

soybean proteins，lipoxygenase，linoleic acid，oxidative modification，Raman

TS201.2+1；TQ645.9+9

A

1003-0174（2015）02-0112-06

“十二五”农村领域国家科技计划（2012BAD34B04-1，2013AA102203-03），江苏省高校自然科学研究（10KJB550001），苏州市科技计划（SYN201211）

2013-12-12

黄友如，男，1966年出生，副教授，粮食、油脂与植物蛋白工程