周 宇，唐连飞，朱事康，朱中武，佟铁铸，禹思宇，林志雄，刘 星，陈燕忠，罗卓军

（1.惠州出入境检验检疫局技术中心，广东惠州 516006；2.湖南出入境检验检疫局，湖南长沙 410004；3.广东出入境检验检疫局，广东广州 510623）

猪博卡病毒的基因分型

周 宇1，唐连飞2，朱事康1，朱中武2，佟铁铸1，禹思宇2，林志雄3，刘 星1，陈燕忠1，罗卓军1

（1.惠州出入境检验检疫局技术中心，广东惠州516006；2.湖南出入境检验检疫局，湖南长沙410004；3.广东出入境检验检疫局，广东广州510623）

为了解猪博卡病毒（PBoV）的遗传进化规律，研究可行的 PBoV 基因分型方法，本研究利用 GenBank中登录的 29条 PBoV 和2条本实验室测得的全基因组序列信息，采用生物信息学软件进行基因组序列分析。结果显示，分别以NS1 基因、NP1 基因和 VP1 基因编码氨基酸构建的系统进化树，PBoV 均被划分为 3 个基因群，但三种氨基酸序列绘制的进化树存在差异；基因群内各病毒株的氨基酸序列同源性较高，而各基因群之间病毒株的氨基酸序列同源性非常低，基因组结构差异较大。

猪博卡病毒；遗传进化分析；基因分型

猪博卡病毒（porcine Bocavirus，PBoV）为细小病毒科细小病毒亚科博卡病毒属成员，基因组为单链线状 DNA，基因组约 5.0 kb，含有 3 个开放阅读框（ORFs），编码 2 个非结构蛋白 NS1和 NP1，以及 2个结构蛋白，即衣壳蛋白 VP1和VP2[1]。其中 VP1/VP2存在部分重叠，是病毒的主要抗原蛋白。目前已经在多种动物（包括人）体内检测到博卡病毒[2]，并且PBoV 各株间基因组大小差异较大。2009 年瑞典研究人员首先在患有仔猪断奶多系统衰竭综合征的病猪中获得一段1879 bp的核苷酸序列，该序列与 HBoV 序列相似，包括完整的 NP1 基因和部分 VP1/VP2 基因，因此暂时将其命名为猪类博卡病毒（Porcine boca-like virus，PBo-likeV）[3]。随后，各国在发病或健康猪的样品中获得了 PBoV 的全长或接近全长基因组序列，证明了 PBoV 确实在猪体内普遍存在。目前在 PBoV的检测方法、流行病学、全基因扩增等方面已经取得了较大进展[4，5]，但在基因分型、病毒分离、致病性等方面的研究还比较薄弱。最初根据该病毒发现的先后将PBoV分为 5个基因型[6，7]，国内也有学者将其分为7个基因表型（PBoV1-5、PBoLV、PPV4）[11]。还有一些研究人员在获得 PBoV 全基因组序列后，并未进行 PBoV 基因分型。目前对PboV的基因分型方法的建议主要是2013年国际病毒分类委员会（ICTV）建议的博卡病毒分类标准，建议以NS1基因编码的氨基酸同源性为依据，将氨基酸同源性＞85%划分为同一种群，氨基酸差异＞15%的划分为不同种群，将猪博卡病毒分为4个种群。也有一些学者认为博卡病毒的分型应该以VP1基因为依据，Kapoor等[7]基于对HBoV中大量VP1基因进行系统进化分析提出了新的HBoV分类标准：病毒间VP1氨基酸差异＞8%且核苷酸差异＞10%时归为不同种;VP1氨基酸差异＞1.5%且核苷酸差异＞5%时归为不同基因型；覃绍敏等[9]通过基因序列比较和基因进化树分析，提出将PboV划分为PBoV1-3三个基因型。通过对以上观点的综合考虑，本研究参考 GenBank 中登录的所有 PBoV 全基因组序列（包括3个完整 ORFs）和本实验室测得的2株PboV的全基因序列，采用生物信息学软件进行各基因编码的氨基酸序列同源性和遗传进化分析，研究并讨论 PboV可行的基因型分类方法。

1 材料和方法

本实验室测得的两株PBoV 全基因组序列命名为GD4（KJ755665）和GD18（KJ755666），再从GenBank上获取29条PboV的全基因组序列信息，序列包括国内全部毒株，美洲、欧洲、非洲部分不同基因型毒株。基于国际病毒分类委员会（ICTV）根据氨基酸序列相似性对细小病毒进行分类的原则，截取每条序列完整的 ORFs 部分（NS1、NP1、VP1/VP2），采用 DNAStar 生物信息学软件翻译成氨基酸序列并通过 Clustal W算法进行同源性分析，采用MEGA5.1绘制系统遗传进化树，并引入了一条外群序列HM031134（猪细小病毒4型），对得到的可信树进行分析。引用的基因登录号为：HQ223038、HM053693、HM053694、 HM031134、JN831651、HQ291308、HQ291309、JF429834、JF429835、JF429836、JF512472、JF512473、JF713715、JF713714、JX854557、KC473563、KF206165、KF206155、KF206157、KF206167、KF206154、KF206161、KF206162、KF206166、NC-023673、KF025390、KF025394、KF206156、JN681175和JN621325。

2 结果

2.1 氨基酸遗传进化分析

将 29条 PBoV 的NS1 编码氨基酸、NP1 编码氨基酸、VP1/VP2 编码氨基酸的进行序列相似性分析，并构建系统进化树（图1、2、3）。结果显示选取NS1 编码氨基酸、NP1编码氨基酸 和 VP1编码氨基酸所构建的系统进化树均分为2个大分支，参照外群基因发现，两个平行的大分支集中了较多的毒株序列；次一级分支均为3个（除去bootstrap 值小于60%的小分支）较大的分支，将三个大分支分别命名为G1群、G2群、G3群，但是各分支的位置却不同，以HQ291308株（“☆”标注）为例，以VP1/VP2 编码氨基酸构建进化树时其与其它3个毒株处于一个大的独立分支上（图1）；以NS1 编码氨基酸、NP1编码氨基酸构建进化树时，HQ291308株却与另一个分支同处于一个大分支上，而不是独立的分支（图2、3）。因此，VP1/VP2编码氨基酸和NS1编码氨基酸、NP1编码氨基酸在进化关系上存在很大差异，可能来自于不同的祖先；G1群和G2群包含的毒株较多，并且存在一些小的分支，这些小分支在 3 个系统进化树中存在一定差异性，而且有些bootstrap 值较低，再进一步划分还需要更多数量的基因序列。覃绍敏等[9]和Yang等[13]经过基因序列和遗传进化分析提出可以考虑将PboV划分为PBoV1、PBoV2和 PBoV3三个基因群。本研究认为从进化关系观察分为3个群也是可行的，但以不同编码氨基酸为依据进行分类在进化关系上不同；如图所示，所有序列明显分为两个大分支，根据NS1和NP1的系统进化树G2群和G3群处于同一分支，而根据VP1/VP2绘制的系统进化树G1群和G2群处于同一个分支，因此推测猪博卡病毒的结构蛋白VP1/VP2和非结构蛋白NS1，NP1在进化关系上存在差异，尤其是G3群病毒的结构蛋白处于独立进化分支，而非结构蛋白与G2群病毒关系密切。

图1 VP1/VP2 氨基酸进化树

图2 NP1氨基酸进化树

2.2 氨基酸同源性分析

根据2.1 PBoV的基因分群情况，分别进行PBoV 基因群内和群间氨基酸序列同源性分析（图4、5、6）。表 1结果显示，以 NS1、NP1、VP1/VP2编码氨基酸序列进行比较，基因群内的氨基酸同源性均较高，G1群内同源性最高为 98.8%，G2群内同源性最高为 98.6 %，G3 群内同源性最高为99.5 %；而基因群间的氨基酸同源性非常低，G1 群和G2 群之间最高为 43.6 %，最低为 31.1 %，G1群和G3群之间最高为42.4 %，最低仅为 25.1%，G2群 和G3群之间最高为 48.4 %，最低37.9%。由此表明PBoV 各株之间的氨基酸序列具有多样性，基因群内的病毒株具有较高的保守性，而不同基因群的病毒株间差异较大；G1 群和G2 群病毒株VP1 基因编码氨基酸序列同源性为 38.2%～41.5 %，G1群和G3 群同源性 为 29.4%～36.8 %，G2 群和G3 群同源性为44.3%～48.4 %，均低于50 %；而各群内病毒株的VP1/VP2 基因编码氨基酸序列同源性最低为73.3%，群间氨基酸序列相似性较低，群内氨基酸序列相似性较高，如果以VP1/VP2或NS1 基因编码氨基酸序列同源性高低为依据进行基因分型是可行的。PBoV 各基因编码氨基酸序列同源性分析结果与之前的氨基酸序列进化分群结果相一致。从表中可以看出NS1的群间氨基酸同源性高于其余两种蛋白，均在36%以上，满足国际病毒分类委员会（ICTV）中关于病毒分属的要求。目前G3群只有4条全基因序列，在进行氨基酸同源性比对时发现一个特殊的毒株HQ291308，该毒株的NP1，VP1/VP2与其它3个毒株的的相关氨基酸序列同源性很高，在97.6～99.5%之间，但是NS1与其它3个毒株的相关氨基酸序列同源性最高只有81.0%。按照ICTV的分类方法将其分为一个独立的Ungulate bocaparvovirus 3型，但是在系统进化树上，该毒株并不处于一个独立分支（见进化树“☆”标注），还需要更多的序列进行研究。

图3 NS1氨基酸进化树

表 1 PBoV 编码氨基酸同源性分析结果

图4 NS1氨基酸同源性

图5 VP1/VP2 氨基酸同源性

图6 NP1 氨基酸同源性

3 讨论

2013年国际病毒分类委员会（ICTV）对博卡病毒的分类进行了调整，之前建议将NS1基因序列同源性＞95%划分为同一种群，随着博卡病毒全基因序列的不断发布，建议以NS1氨基酸相似性＞85%为同一种群进行分类。并将猪博卡病毒分为Ungulate bocaparvovirus 2（包括HM053693、HM053694、HQ291309），Ungulate bocaparvovirus 3（HQ223038），Ungulate bocaparvovirus 4（HQ291308），Ungulate bocaparvovirus 5（JF429834、JF429835、JF429836）4个种群。本研究通过对氨基酸遗传进化和同源性进行分析，发现同种群猪博卡病毒的同源性较高，在进化分支上处于同一分支，对其进行基因分型具有可行性。但G1群和G3群的毒株多样性显著，G1群内毒株NS1同源性在74.7～98.8%之间，结合ICTV的以NS1氨基酸相似性＞85%为同一种群的分类方法进一步划分比较合适。目前已经有KF206154，JN831651，JF512473，JN621325和 KF025394，JN681175两个新的种群，可以命名为Ungulate bocaparvovirus 6和Ungulate bocaparvovirus 7。

一些学者认为VP1/VP2能够在很大程度上影响病毒的组织嗜性及潜在致病性，应该以编码VP1/VP2的核苷酸序列相似性高低作为分类标准[12]，可以考虑将VP1/VP2作为基因分型的首选基因[9]。观察3个系统进化树和相似性比较发现以NS1为依据和以VP1/VP2为依据进行分群在进化关系上存在不同，但是得到的结果一致，G1和G2群内包含的毒株一致；不一致之处在于G3群中的HQ291308株，以NS1为依据，按照氨基酸序列相似性＞85.0%划分为同一种群进行划分，它应该属于独立种群。但如果以VP1/VP2为依据，它与HQ223038同源性高达98.4%，它们应该属于同一个种群。因此病毒的分类方法还需要不断的补充完善。但为做到猪博卡病毒基因分型研究的一致性，应该按照ICTV的统一标准，根据NS1氨基酸相似性进行分类。

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Studies on Genotyping of Porcine Bocaviruses

Zhou Yu1，Tang Lianfei2，Zhu Shikang1，Zhu Zhongwu2，Tong Tiezhun1，Yu Siyu2，Lin Zhixiong3，Liu Xing1，Chen Yanzhong1，Luo Zhuojun1
（1.Huizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huizhou，Guangdong 516001；2.Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changsha，Hunan 410004；3. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510623）

To analyze the genomic characteristics and classify the genotypes of porcine Bocavirus（PBoV），the complete genomic sequences of 29 PBoVs available in GenBank and 2 PboVs detected by our laboratory were analyzed for the homology of NS1，NP1，VP1 amino acid sequences by bioinformatics software. The results showed that PBoV could be divided into three groups based on phylogenetic tree established according to PBoV NS1，NP1，VP1 amino acid sequences，but there were also some noticeable differences among them：the viruses in the same group shared higher sequence identity and those in different groups shared lower sequence identity.

porcine Bocavirus（PboV）；phylogenetic analysis；genotyping

S852.651

：A

：1005-944X（2015）02-0063-06

国家质检总局项目（2014IK243）