曾 超，李应广，古超云，林翠霞（广东医学院基础医学院病理学教研室，广东东莞523808）

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内发病率仅次于肺癌，位居第2 位[1]。我国是胃癌的高发区，不久前召开的第8 届全国胃癌学术大会公布的数据显示，我国每年新发胃癌40万例，发病约占全世界的42%，但目前关于胃癌发病的具体分子机制仍不清楚。14-3-3 蛋白是哺乳动物细胞中含量较丰富的蛋白之一。真核细胞中14-3-3 蛋白通过与相关蛋白质相互作用，启动细胞周期并监测DNA 损伤状态，并可激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK），从而抑制细胞凋亡，与整联蛋白（integrin）协调作用，调控细胞生长[2]。近年来，越来越多的研究证实，14-3-3 蛋白家族在肿瘤的形成和发展过程中起着非常重要的作用。14-3-3 蛋白在组织细胞中含量丰富，由7 个亚型组成（ε、β、γ、σ、λ、ζ、η），具有高度保守的蛋白序列结构，参与多种重要的细胞生理过程，包括信号转换、免疫应答、凋亡和转录调控、调节黏附和细胞运动等[2]。最新研究表明，14-3-3σ 蛋白被认为是这7 个蛋白亚型中与癌症的发生、发展关系最密切的蛋白。目前为止，14-3-3σ 蛋白与胃癌的关系国内外均很少报道。本实验应用组织芯片技术结合免疫组织化学（免疫组化）方法检测14-3-3σ蛋白在胃癌组织中的表达情况，并进一步统计分析14-3-3σ 蛋白表达与胃癌各临床参数的关系，以期为胃癌的基因治疗寻找有效的分子靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择75 例胃癌手术患者癌组织及相应癌旁正常胃黏膜组织，患者年龄30～84 岁，中位年龄65 岁；男50 例，女25 例。胃癌临床分期Ⅰ期9 例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期37 例，Ⅳ期1 例；肿瘤分化程度，高分化33 例，低、中分化42 例；肿瘤累及淋巴结48 例，未侵犯淋巴结27 例。。

1.2 材料与试剂 组织芯片（OD-CT-DgStm01-014）购自上海芯超生物科技有限公司，鼠抗人14-3-3σ 蛋白多克隆抗体（MS-1185）购于美国Santa Cruz 公司；即用型免疫组化超敏链霉素抗生素蛋白-过氧化物酶连结法（SP）试剂盒（KIT-9701）、浓缩型3，3-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组化SP 法 组织芯片采用微波抗原修复，单克隆14-3-3σ 蛋白一抗稀释度1∶100，二抗为生物素标记，DAB 显色，苏木素对比染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。观察结果以胞浆呈棕色颗粒为阳性。实验步骤按照SP 法实验试剂盒进行操作。

1.2.2 免疫组化结果评判 14-3-3σ 蛋白阳性表达主要定位于胃癌细胞胞浆。阳性表达评定以肿瘤细胞染色强度和肿瘤细胞阳性细胞比例的乘积决定。肿瘤细胞染色强度评分按未见着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别判定为0、1、2、3 分；阳性肿瘤细胞比例评分如下：阳性细胞数小于5%、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～＜75%、≥75%，分别给予0、1、2、3、4 分。肿瘤细胞强度和阳性细胞数评分的乘积：＜2 分评定为阴性（-），≥2 分评定为阳性（+）。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0 统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 14-3-3σ 蛋白在胃癌组织与癌旁组织中的表达 组织芯片研究结果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌组织中表达主要定位于胞浆，其阳性表达肿瘤细胞呈弥散性散在分布，见图1。统计学研究结果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为88.0%，而在相应癌旁组织的阳性表达率为34.7%，两组间14-3-3σ 蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P=0.001），见表1。

图1 组织芯片检测胃癌组织中14-3-3σ 蛋白的表达

表1 胃癌组织与癌旁组织中14-3-3σ 蛋白的表达

2.2 胃癌组织中14-3-3σ 蛋白的表达与临床病理特征的关系

统计学分析结果显示，14-3-3σ 蛋白在胃癌组织中的表达与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、临床分期均无显著相关性，而与肿瘤大小有密切相关性，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 胃癌组织中14-3-3σ 蛋白的表达与临床病理参数的关系[n（%）]

3 讨 论

研究发现，14-3-3 蛋白家族主要通过调节肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、细胞凋亡及相关信号通路等参与肿瘤的发生和发展[3-6]。Fanger 等[7]发现14-3-3ζ 蛋白可结合在促分裂原细胞外激酶-Ⅰ（MEKKⅠ）的调控结构域，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的作用，从而抑制细胞凋亡。14-3-3β 蛋白包含1 个可与整联蛋白β1（integrin β1）相互作用的结合位点，它们之间的相互作用促进细胞扩散和迁移[8]。14-3-3γ 蛋白在人类肺癌细胞系H322中过表达可导致异常的DNA 复制和多倍体化，14-3-3γ 蛋白的过表达可使细胞绕过有丝分裂监测点，而促使肿瘤细胞异常增殖[9]。

目前研究表明，14-3-3σ 蛋白是14-3-3 蛋白家族中与肿瘤关系最为密切的蛋白。14-3-3σ 蛋白主要受抑癌基因p53 的调控，而p53 基因的损伤，可以直接影响14-3-3σ 蛋白的表达水平[10]。Pei等[11]研究表明，14-3-3σ 蛋白在大肠癌中表达上调。与此类似的是，Agarwal 等[12]使用免疫染色发现14-3-3σ 蛋白仅在胰腺癌组织中有表达，而在正常胰腺组织和慢性胰腺炎组织中无表达。值得注意的是，Yang 等[13]研究发现，14-3-3σ 蛋白在乳腺癌中处于低表达状态。以上研究结果提示，14-3-3σ 蛋白在不同类型肿瘤中的表达情况可能并不一致，14-3-3σ 蛋白在各种肿瘤的发生、发展中所起的作用也可能不同。

本研究结果显示，14-3-3σ 蛋白在胃癌组织与癌旁组织中的阳性表达率分别为88.0%和34.7%，提示14-3-3σ 蛋白可能参与了胃癌的发生和发展。王凤超等[14]曾经报道，14-3-3σ mRNA 在胃癌中的表达水平较低，这与本研究结果有差异。推测可能是以下2 种原因导致了这种差异。首先，可能是所选取胃癌样本的差异及样本总体数量的差异；其次，王凤超等[14]是在RNA 水平对14-3-3σ 基因表达进行研究。众所周知，蛋白质才是决定细胞生物学功能的最终产物。而基因的表达到最终蛋白质的形成需要经过一系列复杂过程，例如复制、转录和翻译。而RNA 的表达情况仅体现14-3-3σ基因的转录水平。从RNA 到蛋白质还需要经过转录后修饰和翻译阶段。因此，为了深入了解14-3-3σ 基因在胃癌发生、发展中可能起到的重要生物学作用，本研究主要是集中在蛋白质水平对14-3-3σ 蛋白进行探讨， 这种研究层次的差别也可能导致得出与王凤超等[14]研究相异的结果。

本研究结果表明，14-3-3σ 蛋白在胃癌中的表达与患者的年龄、性别、病理分级、浸润深度、有无淋巴结转移、临床分期等均无显著相关性，这与王凤超等[14]在mRNA 水平上的研究结果一致。统计结果显示，14-3-3σ 蛋白阳性表达的差异与肿瘤大小存在显著相关性，表明该蛋白的表达与细胞增殖或凋亡存在某种联系。肿瘤体积的大小是恶性肿瘤的重要生物学特性，近年来的研究也表明，肿瘤大小可作为胃癌的重要预后指标[15-17]。而14-3-3σ 蛋白与胃癌细胞增殖和凋亡能力的相关性及其可能涉及的具体分子机制是下一步研究的重点。

综上所述，14-3-3σ 蛋白的过表达可能参与了胃癌的发生、发展。考虑到14-3-3σ 蛋白表达与肿瘤大小的密切相关性，推测其可能与胃癌细胞的增殖或凋亡存在一定的联系。本研究为阐明胃癌发生、发展的分子机制提供了有效的实验依据，但14-3-3σ 蛋白参与胃癌细胞增殖或增殖的相关具体分子机制尚待进一步深入研究。

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