王超，何梓钰，査应洪，杨淑仪，杜冰

1(华南农业大学 食品学院，广东 广州，510642)

2(红河群鑫石斛种植有限公司，云南红河，661200)

石斛属植物，按形态、产地等可分为铁皮、金钗、黄草、霍山等数十个品种，其中以铁皮石斛最为珍贵。铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的干燥茎［1］，因其表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛含有大量的活性物质，主要为石斛多糖［2］、石斛碱［3］、类黄酮、氨基酸、芪类及其衍生物以及多种挥发性成分［4］，除具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力［5］等作用，还具有扩张血管、降低血压［6］之功效。铁皮石斛除可鲜食外，还可炖汤、泡茶和浸酒［7］。通常加工成干品，如铁皮枫斗［8］。此外，还可制成功能性饮料［9］。本文选用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别接种发酵石斛汁。制成的石斛汁乳酸饮料不仅较好地保存了营养物质，而且综合了乳酸发酵的优点，集石斛汁精华与乳酸菌的功能性于一体。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁皮石斛:购于红河群鑫石斛种植有限公司。

乳酸菌种:植物乳杆菌(Lp-115)、鼠李糖乳杆菌(LR-54)、凝结芽孢杆菌(TQ-33)，本实验室保存。

MRS培养基，广东环凯微生物科技有限公司;蛋白胨、牛肉膏，北京奥博星生物技术有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

pH S-25型pH计，上海精密科学仪器有限公司;FA1104N电子天平，上海精密科学仪器有限公司;JM-L50胶体磨，上海斯迈克轻工设备厂;YXQ-LS-5OS型立式蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;SW-CJ-1D型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司;GHX-9270 B-2隔热式恒温培养箱，上海福玛试验设备有限公司;101-2S4电热鼓风恒温干燥箱，上海迅能电热设备有限公司;打浆机，美的集团公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 石斛汁的制备

取新鲜铁皮石斛茎，用清水洗净，切成小段，文火煮沸10 min后趁热打浆，浆水后用胶体磨研磨，分别进行粗磨和细磨各1次。

1.3.2.2 石斛汁加热杀菌

在90℃，10～15 min下灭菌，以杀灭石斛汁中有害微生物。

1.3.2.3 接种、发酵和冷藏

将灭完菌的石斛汁冷却至40℃以下，接入乳酸菌发酵剂，在37℃恒温发酵48 h后置于4℃冰箱中冷藏。

1.3.3 测定指标与测定方法

pH值用采用pH S-25型酸度计测定;总酸的测定采用电位滴定法［11］(以乳酸计);还原糖的测定采用直接滴定法［12］;氨基态氮的测定采用甲醛值法测定［13］;乳酸菌活菌数采用平板计数法［10］测定，参考GB/T 4789.35-2010。

1.3.4 感官评价指标

感官评价标准见表1，相关评价方法参考 GB/T 12315-2008。

表1 感官评价标准表Table 1 Standards of sensory evaluation

2 结果分析

2.1 发酵过程中活菌数的变化规律

将凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌分别接入石斛汁中进行对比发酵，接入的初始活菌数约为7.08 lg(CFU/mL)，接种开始记为0 h，在发酵过程中间隔取样，分别测定3种石斛汁中的活菌数，结果如图1所示。

图1 发酵过程中活菌数的变化Fig.1 Change of viable cell count in fermentation

从图1可以看到，3种乳酸菌在发酵过程经历了短暂的延迟期，延迟期的长短与菌种、菌龄、培养条件等密切相关［15］。凝结芽孢杆菌延迟期较短，很快进入对数生长期。菌体数目呈几何级增长，并且凝结芽孢杆菌在对数期的增长速度相比另外两种菌要快。第12 h左右开始进入稳定期，由于营养物质的逐渐消耗以及pH值的降低，凝结芽孢杆菌的繁殖率和死亡率趋于平衡，至发酵结束时活菌数基本不变，第48h时活菌数达到9.47 lg(CFU/mL)。鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌分别在12、18 h时左右进入稳定期，至发酵结束时活菌数分别为9.33、8.95 lg(CFU/mL)。与0h的活菌数相比，凝结芽孢杆菌增加的数量是3种菌株中最高的，从7.08 lg(CFU/mL)增长至9.47 lg(CFU/mL)，表明其在石斛汁中具有优良的增值活性。

2.2 发酵过程中总酸变化规律

接种开始计为0 h，在发酵过程中进行间隔取样，分别测定3种石斛汁中总酸的变化情况，结果如图2所示。

图2 发酵过程酸度的变化Fig.2 Change of acid degree in fermentation

由图2可以看出，3种乳酸菌发酵石斛汁的总酸含量在0～6 h时均缓慢增加，随后迅速上升，第36 h之后无显著变化，至发酵结束时，凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵石斛汁的乳酸含量分别为7.85、6.93、7.66 mg/mL。这是因为经过短暂的适应期后，乳酸菌利用石斛汁中的糖分作为碳源，通过代谢产生大量乳酸，但由于石斛汁中可供乳酸菌利用的碳氮源有限，发酵后期乳酸菌产酸速度降低。从产酸能力和速率来说，凝结芽孢杆菌与鼠李糖乳杆菌差别不大，而两者要优于植物乳杆菌。

2.3 发酵过程中pH值变化规律

接种开始计为0h，在发酵过程中进行间隔取样，分别测定3种石斛汁中pH值的变化情况，结果如图3所示。

图3 发酵过程中pH值的变化Fig.3 Change of pH value in fermentation

由图3可以看出，随着发酵时间的延长，石斛汁的pH值不断下降，这主要是乳酸菌产生乳酸等酸性物质的缘故。发酵开始时，由于凝结芽孢杆菌需要适应新环境，产酸较少，这一时期石斛汁的pH值变化不明显。6 h之后，凝结芽孢杆菌进入对数生长期，石斛汁的pH值迅速下降，至第12 h，pH值由5.84下降至4.23。植物乳杆菌在发酵开始时由于产酸较少，pH值下降缓慢，6 h之后石斛汁的pH值下降速度加快，至第18 h，pH值由5.93下降至4.08。鼠李糖乳杆菌从第6h左右进入对数期，产酸趋势开始明显，第36 h之后，由于产酸速度放缓，pH值呈缓慢下降的趋势。

2.4 发酵过程中氨基态氮的变化规律

接种开始计为0 h，在发酵过程中进行间隔取样，分别测定3种石斛汁中氨基态氮含量的变化情况，结果如图4所示。

图4 发酵过程中氨基态氮的变化Fig.4 Change of amino nitrogen in fermentation

从图4可以看出，3种乳酸菌在发酵石斛汁的过程中氨基态氮含量的变化不显著，但不同乳酸菌对蛋白质的利用情况有一定差别。由于乳酸菌缺乏合成几种必需氨基酸的能力，故乳酸菌须通过蛋白酶系降解生长环境中的蛋白质，主要通过菌体细胞壁蛋白酶和肽酶的分解作用获得游离氨基酸和多肽［14］。凝结芽孢杆菌在发酵前期的氨基态氮含量比发酵后期高，而植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵过程中氨基态氮的含量无明显变化。可能是由于凝结芽孢杆菌分解蛋白质和利用氨基酸的能力比植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的强，所以凝结芽孢杆菌在发酵前期分解蛋白质得到较多的多肽和游离氨基酸，在发酵后期利用的量也比另两种菌多。

2.5 发酵过程中还原糖的变化规律

接种开始记为0 h，在发酵过程中进行间隔取样，分别测定3种石斛汁中的还原糖含量，结果如图5所示。

图5 发酵过程中还原糖的变化Fig.5 Change of reducing sugar in fermentation

从图5可以看到，随着发酵过程的进行，石斛汁内的还原糖不断被消耗。在发酵前期，乳酸菌消耗还原糖速率较快，至发酵后期，还原糖含量消耗速度缓慢，这与发酵后期酸度变化情况相对应。此外，不同菌种在发酵过程中对石斛汁中还原糖的利用情况存在差异，植物乳杆菌消耗糖的速率要低于凝结芽孢杆菌与鼠李糖乳杆菌。在未添加任何碳氮源的前提下，发酵48 h后，植物乳杆菌发酵石斛汁中的还原糖含量减少了67.28%，凝结芽孢杆菌与鼠李糖乳杆菌发酵石斛汁中还原糖含量分别减少了78.64%、76.85%。

3 结论

(1)在乳酸菌发酵石斛汁的过程中，凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌都存在延迟期、对数期和稳定期。其中，凝结芽孢杆菌的延迟期最短，很快进入对数生长期，从第12 h便进入稳定期，至发酵结束活菌数为9.47 lg(CFU/mL)。植物乳杆菌的延迟期较长，从第6 h起进入对数生长期，第18 h进入稳定期，至发酵结束活菌数为8.95 lg(CFU/mL)。

(2)发酵石斛汁过程中，由于乳酸菌不断利用其中的可发酵糖生成乳酸等酸性物质，pH值不断降低，酸度不断增加。发酵48 h后，植物乳杆菌发酵石斛汁的乳酸含量为6.93 mg/mL，凝结芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵石斛汁的乳酸含量分别为7.85、7.66 mg/mL。从3种乳酸菌在发酵石斛汁过程中的产酸速度和产酸能力来说，凝结芽孢杆菌略优于鼠李糖乳杆菌，鼠李糖乳杆菌优于植物乳杆菌。

(3)在未添加其他碳氮源的条件下，发酵48 h后，植物乳杆菌发酵石斛汁中的还原糖含量减少了67.28%，凝结芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌发酵石斛汁中还原糖含量分别减少了78.64%、76.85%。

(4)对3种乳酸菌发酵所得石斛汁进行感官评价，分析评价的指标有口感、色泽、香气及组织状态，各指标的评分标准见表1。感官评价总分为口感评分、色泽评分、香气评分和组织状态评分之和。共有20位有品尝经验的老师和研究生作为评价员对发酵石斛汁进行感官评价，凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌发酵石斛汁的感官评价最终结果依次为84分、75分、89分。综合产酸速度、还原糖利用率、活菌数、产品感官等指标考虑，确定发酵菌种为鼠李糖乳杆菌。

［1］ 国家药典委员会.中国药典(一部)［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［2］ ZHA Xue-qiang，LUO Jian-ping，Bansal V，et al.Enzymatic fingerprints of polysaccharides of Dendrobium officinale and their application in identification of Dendrobium species［J］.J Nat Med，2012，66(3):525-534.

［3］ 诸燕，张爱莲，何伯伟，等.铁皮石斛总生物碱含量变异规律［J］.中国中药杂志，2010，35(18):2 388-2 390.

［4］ 聂少平，蔡海兰.铁皮石斛活性成分及其功能研究进展［J］.食品科学，2012，33(23):356-361.

［5］ Tzi B N，LIU Jing-yi，WONG J H.Review of research on Dendrobium，a prized folk medicine［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，93(5):1 795-1 803.

［6］ LI Biao，WEI Jin-min，WEI Xiao-lan.Effect of sound wave stress on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation of Dendrobium candidum［J］.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces，2008，63(2):269-275.

［7］ 王伟英，邹晖，陈永快.铁皮石斛的综合利用与展望［J］.中国园艺文摘，2011(1):189-192.

［8］ 柳莲芳.铁皮石斛的最新研究进展［J］.安徽农业科学，2012，40(11):6 426-6 428;6 430.

［9］ 杨兵勋，沈春香，王增，等.HPLC法测定铁皮石斛饮料中D-甘露糖的含量［J］.食品科学，2011，32(8):275-277.

［10］ GB 4789.35-2010.食品安全国家标准食品微生物检验乳酸菌检验［S］.

［11］ 丘裕，陈中，林伟锋，等.圣女果汁发酵的研究［J］.食品与发酵工业，2010，36(8):210-212.

［12］ 张水华.食品分析［M］.北京:中国轻工业出版社，2006.

［13］ 陈杰，徐婧婷，郭顺堂.豆粕热处理对酱曲中蛋白酶活性和酱油中氨基态氮含量的影响［J］.大豆科学，2009(5):889-893.

［14］ 孟祥晨.乳酸菌与乳品发酵剂［M］.北京:科学出版社，2009:348-355.

［15］ 杨汝德.现代工业微生物学教程［M］.北京:高等教育出版社，2006:91-93.