赵昌会+叶德赞

摘要：菌株S3是从厦门石胄头近海海水中分离到的，不产生抗菌活性物质，而产黑色素的一株放线菌。在其形态、培养及生理生化特征、细胞壁组分测定等传统的分类学方法的基础上测定和分析了菌株的16S rDNA序列。结果表明，菌株S3在多种培养基上产黑色素，孢子椭圆或圆柱状，在ISP培养基上培养特征与Streptomyces Puniciscabiei基本一致，菌株S3的16S rDNA序列与S. Puniciscabiei的同源性为99.595%，鉴定其为S. Puniciscabiei。

关键词：链霉菌，黑色素，分类

中图分类号：Q93        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）21-5145-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.023

Taxonomy of the Streptomyces Producing Melanin

ZHAO Chang-hui1，YE De-zan2，3

（1.Hunan University of Science and Engineering， Yongzhou 425100， Hunan， China;

2.The Third Institute of Oceanography， State Oceanic Administration， Xiamen 361005，Fuzhou， China;

3.The Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources of State Oceanic Administration， Xiamen 361005，Fuzhou， China）

Abstract： The actinomycete strain S3 producing melanin with no antibacteria activity was isolated from water samples collected from Shizhoutou of Xiamen in China. Strain S3 was identified by methods of traditional and molecular biological taxonomy including determination of morphological and cultural characteristics， physiological and biochemical properties， cell wall components and 16S rDNA sequences analysis. Results showed that strain S3 produced melanin on many medium. Spores were oval or columned in ship. Cultural characteristics of strain S3 on ISP medium were in close agreement with S. Puniciscabiei. The 16S rDNA sequence of strain S3 had 99.595% similarity with that of S. Puniciscabiei. The strain S3 was identified as S. Puniciscabiei.

Key words： Streptomyces， melanin， taxonmy

黑色素（Melanin）广泛存在于自然界生物体内，是一类由L-多巴、酪氨酸和半胱氨酸氧化或聚合而成的天然或合成色素[1]。它是医药、农业及化妆品行业的一种重要的生产原料。由于从动植物体内提取黑色素的生产过程繁琐、成本高，合成色素一般对人体有害，而产黑色素的微生物资源丰富，且生产工艺简单易行，产品无毒害，稳定性好。因此，研究微生物发酵产生黑色素具有很大的优势[2-4]。产黑色素的微生物有细菌、真菌及放线菌等。目前对陆境产黑色素的微生物研究较多，而对海洋中的微生物的报道较少。本研究从厦门石胄头海水中分离到一株放线菌，该菌具有产黑色素的能力，以期为开发产黑色素的海洋微生物打下基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌种来源  菌株S3，大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii），荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），白假丝酵母（Candida albicans），以上菌株均由国家海洋局第三海洋研究所生物重点实验室保存。

1.1.2  主要试剂及仪器  质粒提取试剂盒购自上海生工;DNA marker、dNTPs、Taq酶等购自Takara公司;Biometre公司PCR扩增仪（T3）;Eppendorf公司微型台式离心机;日本JEOL公司JEM-1230透射式电镜;德国Bruker公司TENSOR 27型红外光谱仪。

1.1.3  培养基  2216E细菌培养基;Tyr发酵培养基[5];酪素培养基[6]及国际链霉菌计划（ISP）推荐的7种培养基[7];LB培养基;黄豆粉煮汁培养基：黄豆粉40 g，冷水调糊后加至1 L煮20 min，经纱布过滤，加入葡萄糖20 g，定容至1 L;孢子形成培养基[8];以上培养基均以人工海水与蒸馏水各半配置，1×105 Pa灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1  样品采集及菌种分离  从厦门石胄头（退潮后的上浮水）、筼筜湖、白城、芙蓉湖、船坞（退潮后的沉积物）采集到5个样品，分别取未稀释的水样及10倍稀释的水样和泥样，涂布于2216E、Tyr及酪素平板上，于28 ℃培养5 d，挑取呈黑色的菌落，进行分离纯化。从石胄头海水中分离到菌株S3。

1.2.2  发酵培养及抑菌试验  将菌株S3在Tyr发酵培养基活化3 d，分别接种于LB培养基和黄豆粉煮汁培养基，28 ℃，180 r/min摇床培养10 d。取发酵液分别接种涂布有待试菌平板的滤纸片上，28 ℃培养检测抑菌活性。

1.2.3  孢子形态及培养特征观察  将菌株S3接种于ISP、2216E和产孢等培养基，28 ℃培养观察菌丝生长变化，利用电子显微镜观察孢子链和孢子形态。

1.2.4  黑色素的提取及鉴定  将菌株S3接种于Tyr发酵培养基，发酵5 d，提取黑色素参考文献[9，10]。取黑色素纯品少量，用溴化钾压片法测红外吸收光谱。

1.2.5  生理生化的测定  参照文献[7，11，12]相关内容。

1.2.6  菌株的鉴定  菌体于液氮迅速冷冻15 s，其余步骤参考文献[13]并加以改进。PCR扩增采用的引物为27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′），反应条件：95 ℃ 5 min;94 ℃ 40 S，56 ℃ 40 S，72 ℃ 2 min，30循环;72 ℃ 10 min。PCR产物用经检测割胶纯化，连接到载体PMDt-vector，转化到感受态细胞E.coli DH 5a中37 ℃培养检测，挑取单菌落37 ℃液体培养过夜，利用试剂盒提取质粒，经酶切鉴定，送交上海美吉生物技术有限公司测序，测序引物为P300（5′-CCAGACTCCTACGGGAGGCAGC-3′），RP500（5′-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCA-3′），PKCT（5'-TGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG-3'）。测序结果用EzTaxon Server version2.1数据库对菌株的16S rDNA序列进行分析，然后用MEGA 4.0软件采用邻接法算法构建系统发育树，并进行亲缘性分析。

2  结果与分析

2.1  菌株S3的形态及培养特征

菌株S3在LB、黄豆粉煮汁培养基中发酵10 d，发酵液除了对黑曲霉有较弱抑制作用外，对其余试验菌株均无抑菌活性。在LB、2216E、Tyr、产孢等培养基上生长2～5 d，菌落呈白色，菌落较小，圆形，突起，光滑（培养一段时间后菌落较干燥），不易挑取，显微镜下菌体呈丝状，菌落周围产生可溶性黑色素，基内菌丝和气生菌丝不发达。在产孢培养基上培养约15 d，有孢子产生，孢子呈白色，椭圆，表面光滑（图1）。菌株S3在ISP培养基上培养5 d，生长状况见表1。在ISP1、ISP3和ISP4上生长良好，气生菌丝白灰色或浅黄色，基内菌丝呈浅黄色;在ISP2、ISP5、ISP6和ISP7上生长较弱，气生菌丝呈白灰色或灰色，基内菌丝在ISP2和ISP5上呈黄色，在ISP6和ISP7上呈灰色，在ISP1、ISP4和ISP5上产生可溶性黄色素，而在ISP7上产生可溶性黑色素。

2.2  菌株S3的生理生化特征

挑取菌株S3的新鲜菌体于3% KOH中，无拉丝现象，革兰氏阳性，H2S、VP及明胶液化试验呈阴性，酶触试验呈阳性，铜离子（0.1 g/L）利于其产生黑色素。菌株S3不利用柠檬酸和木糖，对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖及甘油利用较好，以蛋白胨或酵母膏为氮源时生长较好，在无机氮源上生长较慢（表2）。

2.3  黑色素的鉴定

红外光谱分析表明，样品在3 300～3 400 cm-1、

1 640 cm-1附近有强吸收峰， 在1 450～1 600 cm-1、2 349 cm-1、2 900 cm-1附近有弱吸收峰;1 236 cm-1附近有中强吸收峰（图2），根据文献报道3 300 cm-1处的吸收峰是-OH、-NH2的伸展振动引起，1 643 cm-1处吸收峰主要是C═C、-COO-、C═O伸展振动引起，图2与文献[14]的结果相似。不同来源的黑色素光谱图有所差异，但特征峰所在位置相近，说明其主要功能团较为一致。

2.4  菌株S3的鉴定

菌株S3的16S rDNA序列为1 490 bp，Genebank登录号为JN547724。将该序列与EzTaxon Server version2.1中相关序列进行同源性比对，选取同源性较高的21株链霉菌的16S rDNA序列构建系统发育树，如图3所示。菌株S3与S. Puniciscabiei（AF361785）和S.durhamensis（AY999785）处于进化树的中的同一分支，同源性分别为99.595%和99.389%。S. Puniciscabiei能引起马铃薯的疮痂病，在ISP2培养基上培养20 d，孢子颜色由白色变成紫色或红色，菌株S3的孢子无此变化，在纯培养过程中无吸水现象，生理生化特征与S. Puniciscabiei差别不大，所以将菌株S3应归属于S. Puniciscabiei。

3  小结与讨论

在培养、生理生化及孢子特征的基础上，结合16S rDNA序列分析，将菌株S3鉴定为S. puniciscabiei。2003年Park首次报道了S. Puniciscabiei以来，除了对该菌株的形态特征及分子生物学特征进行了研究外[15]，尚未见该菌株其他方面的报道。GenBank中，菌株S3的16S rDNA序列与韩国和美国学者分别提交的AF361785和AY999785的同源性为99.595%和99.389%。3种菌株都可产生黑色素，但他们产黑色素的培养基有所差异，如菌株S3可在LB、2216E、Tyr、产孢等培养基上产黑色素。

在培养特征和生理生化特征方面，除了对鼠李糖利用不同外，菌株S3与S. puniciscabiei完全一致。在LB及黄豆粉培养上不产生抗菌活性物质，不具有植物病害生物防治潜力，对其是否引起马铃薯疮痂病有待进一步研究，菌株S3产生的黑色素与已知黑色素共性相符合，具有良好的开发潜力，对其产黑色素的发酵条件将做进一步研究。

致谢：本研究菌株的电镜照片由国家海洋局第三海洋研究所谷力老师拍摄，16S rDNA的拼接由厦门大学生命科学学院罗晶晶完成，在此一并表示感谢！

参考文献：

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[15] DUCK H P， JEOM S K， SOON W K， et al. Streptomyces luridiscabiei sp. nov.， Streptomyces puniciscabiei sp. nov. and Streptomyces niveiscabiei sp. nov.， which cause potato common scab disease in Korea[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2003（53）：2049-2054.

（责任编辑  张  毅）

在培养特征和生理生化特征方面，除了对鼠李糖利用不同外，菌株S3与S. puniciscabiei完全一致。在LB及黄豆粉培养上不产生抗菌活性物质，不具有植物病害生物防治潜力，对其是否引起马铃薯疮痂病有待进一步研究，菌株S3产生的黑色素与已知黑色素共性相符合，具有良好的开发潜力，对其产黑色素的发酵条件将做进一步研究。

致谢：本研究菌株的电镜照片由国家海洋局第三海洋研究所谷力老师拍摄，16S rDNA的拼接由厦门大学生命科学学院罗晶晶完成，在此一并表示感谢！

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（责任编辑  张  毅）

在培养特征和生理生化特征方面，除了对鼠李糖利用不同外，菌株S3与S. puniciscabiei完全一致。在LB及黄豆粉培养上不产生抗菌活性物质，不具有植物病害生物防治潜力，对其是否引起马铃薯疮痂病有待进一步研究，菌株S3产生的黑色素与已知黑色素共性相符合，具有良好的开发潜力，对其产黑色素的发酵条件将做进一步研究。

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[15] DUCK H P， JEOM S K， SOON W K， et al. Streptomyces luridiscabiei sp. nov.， Streptomyces puniciscabiei sp. nov. and Streptomyces niveiscabiei sp. nov.， which cause potato common scab disease in Korea[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2003（53）：2049-2054.

（责任编辑  张  毅）