付亚杰，李长栋，荔志云，季 玮，孙建军

低氧是临床各种疾病中极常见的一类病理过程，脑的低氧也是导致机体死亡的重要原因之一。氧自由基的产生、细胞内Ca2+超载、神经递质的毒性作用、相关酶类的变化、炎症反应、线粒体功能的异常、细胞凋亡等都是造成缺血低氧性脑损害的因素。异甘草素(ioshquiritigenin，ISL)为甘草中有效成分之一。文献报道，异甘草素具抗脂质过氧化［1］、松弛血管［2］、抑制血小板聚集、抗病毒、抗肿瘤［3］及雌激素样活性［4］、抗细胞凋亡［5］等多种药理作用。本研究采用体外培养PC12细胞，建立细胞低氧损伤模型，采用Flow cytometry方法检测PC12细胞的凋亡;采用RTPCR技术分析Bc1-2和Bax mRNA水平的表达变化，探讨其对低氧神经细胞的保护作用机制。

材料与方法

1 实验细胞

PC12细胞为兰州大学基础医学院惠赠，本实验室传代培养。

2 主要仪器和试剂

二氧化碳培养箱(美国Thermo Revco公司);超净工作台(美国Sigma公司);低温高速台式离心机(UNIVERSAL116型，德国Hetaeus公司):倒置相差显微镜(CKX41-A32PH型，日本Olympus公司);紫外分光光度(德国Heraeus公司);洁净工作台(SW-CJ-2FD型，苏州洁净化设备有限公司);微量移液器(大龙医疗设备上海有限公司):酶标仪(Bio-Tek公司);-80℃超低温冰箱(MDF-381型，日本三洋有限公司);4℃冰箱(青岛海尔公司):电子天平(AG-135型，瑞士梅特勒公司);电热恒温水箱(江苏仪器厂);稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，日本Olympus公司);水平电泳槽(北京六一仪器厂);胎牛血清(FBS)(购于浙江天杭生物科技有限公司);异甘草素(天津马克生物技术有限公司产品HPLC≥98%，批号:GC-20120203);Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基公司);LDH检测试剂盒(南京凯基公司);SOD检测试剂盒(南京凯基公司)。

3 PC12细胞的培养方法

将装有PC12细胞的冻存管从液氮中取出，迅速投入37℃温水中，边震荡边观察，在1min内将冻存管中液体完全融化。超净工作台内将细胞移入离心管，加入新鲜DMEM培养基3～5ml，1000r/min离心5min，弃上清，加入4ml含10%胎牛血清的培养基，吹打均匀，将细胞移入60mm培养皿中，于37°C，5%CO2培养箱中培养过夜，第2d换液，弃掉未贴壁细胞。当细胞铺满瓶底70%～80%时，吸净培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗1遍，加入1ml 0．25%胰酶消化细胞，显微镜下观察，当细胞圆缩，周边折光性增强时，吸净胰酶，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打细胞，使细胞均匀悬浮于培养液中，将细胞传至新的细胞培养皿中。

4 ISL对正常PC12细胞形态及活力的影响

取对数生长期、突起较多的细胞，胰酶消化，1000r/min离心5min，弃上清，用含10%血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数板计数，调整密度为1×105个/ml，随机接种于96孔培养板中，每孔100μl，四周边孔加200μl PBS填充，过夜，待细胞贴壁。将实验组分为正常组，添加ISL组，后者分别加入终浓度为5、10、20、40、80μg/ml的ISL，每组5个复孔，置于37°C、5%CO2培养箱内培养48h后，显微镜下观察细胞形态学改变，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测不同浓度ISL对PC12细胞的影响。

5 细胞处理、分组与低氧模型建立

取对状态良好、突起较多的细胞，胰酶消化，1000r/min离心5min，弃上清，用含10%血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数板计数，调整密度为1×105个/ml，随机接种于96孔和6孔培养板中，96孔板每孔100μl，6孔板每孔1．5ml;之后分为C(对照组)、H(模型组，即单纯低氧组)、H1(ISL低剂量组)、H2(ISL中剂量组)、H3(ISL高剂量组)，每组5个复孔，待细胞贴壁后，对C、H组不加入ISL，对H1、H2、H3组分别加入2、4、8μg/ml的ISL，加药完成后放入低氧环境中培养，开始计时，按低氧后6、12、24h收取细胞，同时实验，见表1。

表1 实验分组及给予的干预条件

低氧装置为自制三气通气箱，置于37°C、5%CO2培养箱内中，其内充以95%N2+5%CO2混合气体，外接传感器来来控制氧含量，进气口装有过滤膜，以此装置制备PC12细胞低氧模型。

6 指标检测

6.1 流式细胞技术检测PC12细胞调亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次(1500rpm离心5min)，加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞，加入5μl Annexin V-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀。室温、避光、反应5～15min，在1h内进行流式细胞仪的检测。

6.2 RT-PCR法检测Bcl-2、Bax mRNA的变化 取各时间点培养结束后的细胞，提取总RNA，检测RNA的完整性，检测其浓度，取800ng总RNA进行TaKaRa PrimeScript RT Master Mix试剂盒合成cDNA，反应体系为20μl，反应条件为37℃15min，85℃5s。通过荧光定量PCR扩增，反应体系为20μl，95℃3min，95℃10s，60℃30s，分别检测Bcl-2、Bax mRNA的表达水平。

6.3 RT-PCR

(1)引物设计(大连宝生物服务有限公司合成)，基因和引物序列(5'-3')如下:

(2)反 应 体 系:SYBR Premix10μl，引 物(25pmol/ul)0．6μl×2，cDNA 2μl，ddH2O 6．8μl;总体积20μl。

(3)反应步驟:95℃，3min预变性;95℃，10s变性;60℃，30s退火延伸，40个循环。

7 统计学处理

结 果

1 PC12细胞的形态学观察

正常状态下分化的PC12表现出神经元的特性，细胞形态为梭形、多角形，细胞突起长，细胞胞膜光滑，细胞间建立突触连接交联成网状(图1)，传代4h后细胞贴壁生长，细胞分裂迅速，每2～3d即可传代，生命力旺盛，适于实验。

图1 分化型PC12细胞(×400)

2 ISL对正常PC12细胞形态及活力旳影响

实验表明，ISL浓度在10μg/ml以下的实验组细胞存活率与正常组之间没有统计学差异，而20、40及80μg/ml剂量组对PC12细胞有一定的毒性作用(图2)。因此我们选择10μg/ml以下的3个剂量，即2、4、8μg/ml剂量作为给药浓度并进行后续研究。

图2 MTT法测定ISL对正常PC12细胞活力的影响。不同浓度ISL培养48h，数据以±s表示，n=5;与未加药组相比:＊＊P＜0．01

3 低氧对PC12细胞活力的影响及ISL的作用

加入MTT培养4h后细胞内生成蓝紫色结晶甲臜(图3)。左为模型组低氧24h后，出现多量的圆形“空泡”(如箭头所示)，此为死亡的细胞，而在右图，ISL 8μg/ml组低氧24h后，几乎未见空泡形成，而且多数细胞仍保持正常形态，有突起，未聚集成团。

图3 加入MTT培养4h后生成蓝紫色结晶甲臜的情况(×400)。左为模型组，右为ISL 8μg/ml组

MTT结果显示，对照组细胞开始计时后即进入对数期生长，细胞随时间不断分裂增殖，活力随时间增强;而模型组细胞活力明显减弱;ISL组低氧后细胞活力较低氧组增强，细胞存活率增高，两者之间有显著性差异。ISL 8μg/ml组低氧24h效果最为显著(表2)。

表2 ISL对PC12细胞低氧后细胞活力的影响(n=5,±s)

表2 ISL对PC12细胞低氧后细胞活力的影响(n=5,±s)

测定波长为490nm，与低氧组比较:a P＜0．05

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4 AnnexinⅤ/PI双染检测PC12细胞凋亡

细胞低氧损伤后，用AnnexinⅤ/PI双染进行荧光标记，通过流式细胞仪区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限为活细胞，右上象限显示非活坏死细胞，右下象限为调亡细胞。检测发现:低氧24h后，模型组调亡细胞率(36．79±1．26)%较之正常组明显增加，而ISL 8μg/ml组，其调亡细胞数量减少(17．52±1．03)%，活细胞数量较模型组明显增多。提示ISL对低氧损伤引起的细胞调亡具有保护作用。此外，流式细胞仪结果显示对照组细胞有些许调亡和坏死，可能与胰酶消化、吹打等操作损伤PC12细胞有关(表3、图4)。

表3 低氧对PC12细胞调亡的影响以及ISL的作用(±s，n=5)

表3 低氧对PC12细胞调亡的影响以及ISL的作用(±s，n=5)

与对照组比较:##P＜0．001;与低氧组比较:＊＊P＜0．001

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图4 低氧对PC12细胞调亡的影响及ISL的作用。与对照组比较:##P＜0．001;与低氧组比较:＊＊P＜0．001

5 各组Bcl-2 mRNA表达变化

RT-PCR检测低氧24h后细胞，单纯低氧组Bcl-2 mRNA表达低于对照组(P＜0．01)，加药低氧组的Bcl-2 mRNA与模型组相比，表达均有所升高(P＜0．01)(图5)。

图5 各处理组Bcl-2 mRNA的表达变化(24h)。与对照组比较:##P＜0．001;与模型组比较:＊＊P＜0．001

6 各组Bax mRNA表达变化

低氧24h后，模型组Bax表达高于对照组(P＜0．01)，加药低氧组的Bax与模型组相比，表达均有所降低(P＜0．01)(图6)。

图6 各处理组Bax mRNA的表达变化(24h)。与对照组比较:##P＜0．001;与低氧组比较:＊＊P＜0．001

讨 论

甘草是一种应用广泛的传统中药。现代药理表明，甘草除具有镇痛、镇咳、抗炎、抗溃疡、抗变态反应等［6］作用外，还具有明显的神经保护作用［7］。ISL为甘草中有效成分之一，其化学名称为4，2'，4'-三羟基查耳酮，为甘草中的一种有效单体，属黄酮类化合物。

在神经细胞低氧损伤的过程中，神经元的坏死与凋亡同时发生，因此区别坏死和调亡的细胞就成为研究低氧损伤程度及ISL作用方式的重要内容。本课题用Annexin V/PI双染细胞，流式细胞仪检测不同浓度ISL作用下低氧细胞的调亡率，实验发现ISL可降低低氧诱导的细胞调亡，并有一定的浓度依赖性。

Bcl-2最初发现位于滤泡性淋巴瘤t(14，18)染色质处，Bcl-2基因的表达产物主要位于线粒体膜、核膜、粗面内质网上［8］。当细胞受到某种有害因素刺激出现病理改变时，它会发挥抗凋亡作用。Vaux等［9］首次报道Bcl-2能够抑制细胞凋亡，延长细胞生存期。当神经细胞低氧时，细胞内外环境发生改变，致使一些因子成为诱导凋亡发生的因素。研究发现，在受损伤的脑中Bcl-2可抑制神经元及神经胶质细胞的凋亡，其表达增加可防止细胞受外界因素刺激后启动凋亡［10］。Bcl-2抑制缺血低氧性神经细胞损伤的可能机制有:降低细胞内钙［11］，阻断Caspase依赖的内在凋亡启动通路［12］，阻断凋亡诱导因子(AIF)依赖的神经细胞凋亡通路［13］，抗氧化应激作用［14］。1993年，Oltvai等［15］首先发现Bax基因作为一个调控Bcl-2的相关基因，与Bcl-2约有21%的氨基酸序列同源，故认为Bax为Bcl-2家族成员。与Bcl-2抑制细胞凋亡相反，Bax能够促进细胞凋亡，它可能是通过形成Bcl-2-Bax复合物来实现的。Bax并不阻断凋亡，而是对抗Bcl-2抑制凋亡的作用。Bcl-2家族蛋白通过调控线粒体途径，对细胞凋亡发挥作用，其过程十分复杂，任何影响Bcl-2以及Bax表达的因素均可影响细胞的凋亡。我们的实验发现，低氧损伤使PC12细胞Bcl-2 mRNA表达下降，Bax mRNA表达升高，最终使PC12细胞走向凋亡。在低氧损伤中给予ISL，可升高PC12细胞Bcl-2 mRNA的表达，降低Bax mRNA的表达，Bcl-2通过激活抗凋亡机制，稳定线粒体，减轻低氧细胞凋亡，这可能是ISL保护神经细胞抗低氧损伤的机制之一。

本研究显示，ISL能够在基因层面上调Bcl-2 mRNA、下调Bax mRNA的表达，从而减少细胞凋亡。

［1］Cabrerizo S，De La Cruz JP，Lopez-Villodres JA，et al．Role of the inhibition of oxidative stress and inflammatory mediators in the neuroprotective effects of hydroxytyrosol in rat brain slices subjected to hypoxia reoxygenation［J］．J Nutr Biochem，2013，24(12):2152-2157．

［2］Zhan C，Yang J．Protective effects of isoliquiritigenin in transient middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats［J］．Pharmacol Res，2006，53(3):303-309．

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