田晶，孙峥，曾常茜

(1．图们市石岘镇中心卫生院，吉林 图们 133101;2．大连医科大学，辽宁 大连 116044;3．大连大学医学院，辽宁省生物有机重点实验室，辽宁 大连 116622)

本课题组前期实验已证实，透骨草(Phryma leptostachya L．var．asiatica Hara)提取物对人卵巢癌 SKOV－3细胞增殖具有明显的抑制作用［1－2］，但其相关的分子机制尚不清楚。本实验采用吖啶橙染色法观察透骨草提取物对SKOV－3细胞形态的影响，并用免疫组化方法检测透骨草提取物对SKOV－3细胞凋亡相关分子 Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白表达的影响，旨在继续对透骨草提取物抑制SKOV－3细胞增殖的分子机制进行探讨，以期为卵巢癌的治疗寻找新的药物奠定基础。

1 材料与方法

1．1 药品、试剂及仪器

透骨草采自辽宁金州大黑山，经王心毓老先生鉴定为透骨草科植物 Phryma leptostachya L．var．asiatica Hara，加热回流提取浓缩成干膏;鼠抗人Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7抗体(Cell Signaling Technology公司);SP免疫组化试剂盒、DAB显色液(福州迈新生物技术公司);RPMI 1640、小牛血清和胰蛋白酶(美国GIBCO公司);荧光显微镜(CX41，日本 Olympus公司)。

1．2 细胞系及培养

人卵巢SKOV－3细胞由吉林省肿瘤研究所提供;将SKOV－3细胞接种于含10%小牛血清、100 IU/ml青霉素和100mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、5%CO2条件下培养至对数生长期，分组。实验组加入37．8μg/ml透骨草提取物(终浓度)，对照组加入等体积RPMI 1640培养液，继续培养24h。

1．3 吖啶橙染色法观察SKOV－3细胞形态变化

收集实验组和对照组的SKOV－3细胞，用PBS缓冲液洗2次，1000r/min离心5min，用PBS缓冲液调整SKOV－3细胞浓度为1×1010个/L。取1×1010个/L细胞悬液95μl，加入0．1g/L 吖啶橙 5μl(终浓度 5μg/ml)，置37℃孵箱中染色10min。取10μl SKOV－3细胞悬液滴于玻片上，封片，置荧光显微镜下观察，拍照。

1．4 免疫组化法检测 SKOV－3细胞 Caspase－9、Caspase－3和Caspase－7蛋白表达变化

免疫组化法采用SP法。分别收集实验组和对照组的SKOV－3细胞，涂片，丙酮固定;3%H2O2室温孵育15min，消除内源性过氧化物酶;正常山羊血清室温孵育 15min，封闭非特异性抗原;分别与鼠抗人Caspase－9、Caspase－3和 Caspase－7抗体37℃孵育2h，PBS洗3次;与生物素标记二抗室温孵育15min，PBS洗3次;与ABC液室温孵育10min，PBS洗3次。DAB染色，封片，显微镜下观察，细胞浆出现棕色判断为阳性细胞，无棕色者为阴性细胞，计数200个细胞并计算阳性细胞的比例。

1．5 统计学处理

Caspase－9、Caspase－3和 Caspase－7蛋白表达的阳性率用(±s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05认为差异有显著意义。

2 结果

2．1 透骨草提取物对SKOV－3细胞形态的影响

未用透骨草提取物处理的对照组SKOV－3细胞形态比较规则，胞核较大且染色均匀。经37．8μg/ml透骨草提取物作用于SKOV－3细胞24h后，细胞形态不规则，细胞核固缩呈月牙形紧贴在核膜周围。

2．2 透骨草提取物对 SKOV－3细胞 Caspase－9、Caspase－3和Caspase－7蛋白表达的影响

未用透骨草提取物处理的对照组SKOV－3细胞Caspase－9蛋白高表达，细胞浆着棕黄色的细胞量多，经37．8μg/ml透骨草提取物处理后的SKOV－3细胞Caspase－9蛋白表达与对照组相比明显降低(P＜0.05);未用透骨草提取物处理的对照组SKOV－3细胞Caspase－3蛋白高表达，细胞浆着棕黄色的细胞量多，经37．8μg/ml透骨草提取物处理后的SKOV－3细胞Caspase－3蛋白表达明显降低(P＜0．05);未用透骨草提取物处理的对照组SKOV－3细胞Caspase－7蛋白高表达，细胞浆着棕黄色的细胞量多，经37．8μg/ml透骨草提取物处理后的SKOV－3细胞Caspase－7蛋白表达明显降低(P＜0．05)，详见表1。

表1 免疫组化法检测SKOV－3细胞Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白表达结果(±s，n=3，%)

表1 免疫组化法检测SKOV－3细胞Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白表达结果(±s，n=3，%)

注:与对照组比较，△P ＜0．05。

Caspase－9 Caspase－3 Caspase－7对照组组别44．1 ±1．3 49．9 ±1．4 45．5 ±1．3实验组 11．1±1．4 12．6±1．0△ 13．1±0．7△

3 讨论

卵巢癌是妇科肿瘤中病死率最高的疾病，发病率呈不断上升趋势，寻找治疗卵巢癌的新药物是目前亟待解决的问题。本实验用吖啶橙染色法观察透骨草提取物对人卵巢癌SKOV－3细胞形态的影响，结果显示，37．8μg/ml透骨草提取物作用后的SKOV－3细胞形态不规则，细胞核固缩紧贴在核膜周围呈月牙形，说明透骨草提取物可诱导SKOV－3细胞凋亡。

Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引发的级联反应是细胞凋亡过程的中心环节，Caspase－9为凋亡始动子，位于级联反应上游，能在其他蛋白参与下发生活化并激活下游的凋亡效应子Caspase－3、Caspase－7等，并通过切割特异性底物，引起细胞凋亡［3－4］。近期实验研究表明，药物诱导卵巢癌细胞凋亡与卵巢癌细胞Caspases级联反应密切相关［5－8］。透骨草提取物是否通过Caspases级联反应诱导SKOV－3细胞凋亡尚不清楚，本实验用免疫组化法检测透骨草提取物对SKOV－3细胞Caspases家族蛋白表达的影响。结果显示，37．8μg/ml透骨草提取物作用SKOV－3细胞24h后，Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白表达水平与对照组相比均显著下降，说明透骨草提取物可能通过激活 Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白酶的级联反应，引起SKOV－3细胞凋亡。

综上所述，透骨草提取物能诱导SKOV－3细胞凋亡，其机制与激活Caspases级联反应有关。卵巢癌细胞凋亡是一个多基因参与的复杂过程，透骨草提取物是否通过其凋亡相关蛋白诱导SKOV－3细胞凋亡，有待进一步深入研究。

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