王继慧，张小卿，马月丹，张 燚，马贤德，吴景东

1)辽宁中医药大学基础医学院 沈阳110847 2)河南财政税务高等专科学校对外经济贸易系 郑州451464 3)辽宁中医药大学针灸推拿学院 沈阳110847 4)辽宁中医药大学经济管理学院 沈阳110847 5)辽宁中医药大学附属第三医院辽宁省肛肠医院皮肤科 沈阳110003 6)辽宁中医药大学教学实验中心 沈阳110847 7)辽宁中医药大学学生工作处 沈阳110847

#通讯作者，男，1962年10月生，博士，教授，研究方向:中医美容、皮肤衰老与中药抗皮肤衰老研究，E-mail:lnzywjd0719@163.com

人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮层关键组成部分，可合成皮肤胶原蛋白。Leccia 等［1］首次发现长波紫外线(ultraviolet A，UVA)有诱导人皮肤成纤维细胞凋亡的作用。严重的UVA 照射后，人体细胞氧化应激和细胞凋亡均增加［2］。UVA 诱导的细胞凋亡被认为是机体稳态维持和DNA 损伤细胞清除的重要调节机制［3］。绞股蓝味甘、微苦、性寒，归脾、肺、肾三经，因可培补储藏尤具调补脾肺之功，在抗皮肤老化中受到一贯的重视和应用［4-7］。绞股蓝总皂苷(gypenosides，Gyp)为绞股蓝主要药理成分。作者通过观测大鼠Gyp 含药血清对UVA 诱导的光老化人皮肤成纤维细胞中凋亡相关基因和蛋白表达的影响，探讨Gyp 调控细胞凋亡的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂 人永生化皮肤成纤维细胞株HSF 购于上海艾研生物科技有限公司。Gyp(MUST-11031401)购于成都曼斯特生物科技有限公司，用生理盐水配制成相应剂量备用。兔抗人Bax、Bcl-2 抗体、内参β-actin 抗体及HRP 标记的羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司，ECL 发光试剂盒购自北京全式金生物科技有限公司。TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品，批号KGA7071。Trizol 由Invitrogen公司提供。Bax、Bcl-2 及内参GAPDH 引物由北京三博远志生物科技有限公司合成，引物序列如下。Bax 上游引物序列 5'-AAGCTGAGCGAGTGTCT CAAG-3'，下游引物序列 5'-CAAAGTAGAAAA GGGCGACAAC-3'，产物大小178 bp。Bcl-2 上游引物序列5'-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3'，下游引物序列5'-AGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'，产物大小180 bp。内参GAPDH 上游引物序列5'-GT CAGTGGTGGACCTGACCT-3'，下游引物序列5'-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3'，产物大小420 bp。

1.2 实验设备 PCR 仪、电泳仪为北京六一仪器设备厂产品。ChemiImager5500 型凝胶成像分析系统购自美国Alphainnotech Chemi Imager 公司。UVA光源(20 W)购自南京华强电子有限公司。

1.3 Gyp 含药血清的制备 健康雄性SPF 级SD大鼠由中国医科大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(辽)2008-0005。用随机数字表法将20只大鼠(体重200～250 g)分为空白血清组和低、中、高剂量含药血清组4组，每组5 只。依据Meeh-Rubner 公式计算，低剂量含药血清组大鼠Gyp 灌胃剂量80 mg/d，设定中高剂量组给药量分别是低剂量组的2、4 倍，1 次/d，共灌胃7 d。空白血清组灌胃生理盐水。第7 天灌胃结束1 h 后，经主动脉取血保存于促凝管内，室温静置1 h，2 000 r/min 离心10 min，收集上清。每组大鼠血清于同一离心管(50 mL)中混合，56℃水浴灭活，过滤灭菌，冻存备用。

1.4 光老化皮肤成纤维细胞模型的制备 参照陶冶等［8］建立光老化皮肤成纤维细胞模型。HSF 细胞用含体积分数10%胎牛血清和双抗DMEM 培养基于37℃、体积分数5%CO2条件下培养，隔日用2.5 g/L 胰酶消化传代。取对数生长期细胞，用2.5 g/L 胰酶消化后加入新鲜培养液制成细胞悬液，以1×104mL－1接种于25 cm2的培养瓶中，于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养48 h，弃去旧培养液，PBS 清洗3 次至无色，加入2 000 μL PBS，置于UVA 下照射。根据文献［9］计算照射剂量，照射剂量=照射强度×照射时间。照射强度采用紫外线辐照计测量。最终照射剂量为36 J/cm2。

1.5 实验分组 将模型细胞随机分为5组，每组6瓶，分别为模型组、正常血清组和低、中、高剂量Gyp组。细胞经照射后，弃去PBS，模型组加入5 mL 新鲜培养液，正常血清组加入5 mL 含体积分数10%正常大鼠血清的新鲜培养液，低、中、高剂量Gyp组分别加入5 mL 含体积分数10%低、中、高剂量大鼠含药血清的新鲜培养液。培养12 h 后，取细胞用于相关指标的检测。以未照射的HSF 作为空白对照。

1.6 细胞凋亡的TUNEL 法检测 细胞用PBS 漂洗2 次，周围用吸水纸吸干，按TUNEL 法检测试剂盒说明操作，用FITC 标记细胞，荧光显微镜下观察细胞形态。每张爬片选取5 个染色良好视野，计数每个视野中的凋亡细胞，取5 个视野的均数为凋亡细胞数。

1.7 细胞中Bax 与Bcl-2 mRNA 及蛋白表达的检测 采用RT-PCR 法检测细胞中Bax 与Bcl-2 mRNA，PCR 产物经凝胶电泳，于凝胶成像系统中采集图像，以目的基因与内参基因条带积分光密度值的比值表示目的基因mRNA 的表达水平。采用Western blot 法检测Bax、Bcl-2 蛋白，兔抗人Bcl-2 和Bax一抗稀释50 倍，HRP 标记的羊抗兔二抗稀释200倍，ECL 发光试剂盒显像，用图像分析系统分析，以目的蛋白与内参条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

1.8 统计学处理 采用SPSS 16.0 处理数据，组间凋亡细胞数、相应基因mRNA 和蛋白表达水平的比较用采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 6组细胞凋亡检测结果 见表1。

表1 6组凋亡细胞数的比较

2.2 6组细胞中Bcl-2、Bax mRNA 表达的比较见图1、表2。

图1 RT-PCR 法检测6组细胞中Bax(上图)和Bcl-2(下图)mRNA 的表达

表2 6组细胞中Bcl-2、Bax mRNA 表达的比较

2.3 6组细胞中Bcl-2、Bax 蛋白表达的比较 见图2、表3。

图2 Western-blot 法检测6组细胞中Bcl-2(上图)和Bax(下图)蛋白的表达

表3 6组细胞中Bcl-2、Bax 蛋白表达的比较

3 讨论

研究［2-3］认为，UVA 诱导细胞凋亡是一个综合性生化反应过程。研究［10］发现，Bcl-2 基因家族与细胞凋亡的调控密切相关，其在线粒体通路中具有放大死亡受体通路信号的作用;Bcl-2 高表达可抑制凋亡，而促凋亡蛋白Bax 等可使线粒体膜通透性增加，引发细胞凋亡线粒体途径开启。生理状态下Bcl-2 和Bax 形成动态平衡。UVA 辐射可使细胞色素C 在凋亡早期从线粒体中释放进入胞质，进而下调Bcl-2 的表达，并上调Bax 的表达，导致细胞凋亡的发生［11-12］。

该研究中，作者观察到，UVA 模型组细胞凋亡明显增强，Bcl-2 mRNA 和蛋白表达降低，而Bax mRNA 和蛋白表达明显升高，说明UVA 照射激活了人成纤维细胞HSF 的凋亡通路;而Gyp 含药血清干预后，经UVA 照射的HSF 细胞凋亡较未干预细胞明显减弱，Bcl-2 mRNA 和蛋白表达升高，而Bax mRNA 和蛋白表达明显降低，且高剂量Gyp组效果更显著。该研究结果说明Gyp 可通过上调凋亡抑制基因Bcl-2、下调凋亡促进基因Bax 的表达，缓解二者之间的失衡状态，抑制细胞凋亡线粒体通路的活化，最终减少了光老化细胞的凋亡。

综上所述，Gyp 可以逆转UVA 诱导的人皮肤成纤维细胞的凋亡;其作用机制可能是上调抗凋亡基因Bcl-2 和下调促凋亡基因Bax 的表达，缓解Bcl-2和Bax 表达之间的失衡状态，从而抑制了凋亡线粒体信号通路活性。

［1］Leccia MT，Richard MJ，Favier A，et al.Zinc protects against ultraviolet A1-induced DNA damage and apoptosis in cultured human fibroblasts［J］.Biol Trace Elem Res，1999，69(3):177

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［3］Lamore SD，Wondrak GT.UVA causes dual inactivation of cathepsin B and L underlying lysosomal dysfunction in human dermal fibroblasts［J］.J Photochem Photobiol B，2013，123:1

［4］王大伟，吴景东.绞股蓝抗小鼠皮肤衰老的实验研究［J］.四川中医，2008，26(10):17

［5］金晓哲，吴景东，闫海慧.外用中药绞股蓝对紫外线照射无毛小鼠皮肤组织影响的实验研究［J］.中国生物美容，2009(4):16

［6］王彩霞，王丽新.外用绞股蓝对自然衰老小鼠皮肤组织中CAT 活性、MDA 含量影响的实验研究［J］.实用中医内科杂志，2011，25(7):29

［7］李楠，谷继卜，曲桂霞.绞股蓝水煎剂对老龄小鼠SOD 和LPO 的抗衰老研究［J］.黑龙江医药科学，2012，35 (4):41

［8］陶冶，张小卿，吴琼，等.绞股蓝总皂苷含药血清对光老化HaCaT 细胞中p38MAPK 蛋白和c-Jun mRNA 表达的抑制作用［J］.吉林大学学报:医学版，2012，47(10):1178

［9］李薇.长波紫外线对人角质形成细胞和成纤维细胞的形态、数目及诱导型一氧化氮合酶表达的影响［D］.长沙:中南大学，2007.

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