魏小玲，冯斐斐，何其栋，冯悦静，王 威，吴拥军

1)郑州大学公共卫生学院卫生毒理学教研室 郑州450001 2)郑州市第六人民医院呼吸内科 郑州450061 3)郑州大学公共卫生学院劳动卫生与职业病学教研室郑州450001

#通讯作者，男，1968年1月生，博士，教授，研究方向:生化与分子毒理，E-mail:wuyongjun@zzu.edu.cn

肺癌是世界范围内发病率与病死率均居首位的恶性肿瘤，受现有检测手段限制，绝大多数患者首诊为肺癌时已是晚期，5 a 生存率仅为15%，而早期诊断可以改变这一现状［1-2］。DNA 甲基化异常是恶性肿瘤中常见现象，与肿瘤的发生发展密切相关［3］，其基本过程是在DNA 甲基化酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的催化下，以S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)为甲基供体转移甲基到胞嘧啶环的第5 位碳原子(或腺嘌呤环的N6 位)上，生成5-甲基胞嘧啶(或6-甲基腺嘌呤)，得到甲基化的DNA［4-5］。研究［6-7］证实，DNMTs 表达及活性异常是导致肿瘤细胞某些癌基因异常高甲基化的原因，因此是促进肿瘤发生发展的重要因素之一。由于DNA 甲基化出现在几乎所有肿瘤中，并且发生在癌前病变和癌变早期，因此是肿瘤早期诊断的理想标志［8］，改变DNA 甲基化状态，可能为癌症的预防和治疗提供新的策略。作者采用酶联免疫吸附法(ELISA 法)测定血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 的表达情况，探讨DNMTs 应用于肺癌研究的临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 肺癌患者(肺癌组)选自2012年9月至2013年3月郑州大学第一附属医院呼吸内科及河南省胸科医院呼吸内科、均经病理或针吸细胞学证实为原发性肺癌的病例。肺部良性疾病患者(对照组)选自同期郑州市第六人民医院呼吸内科、被证实未合并有肺或其他器官肿瘤的病例。所有入选对象对该研究均知情并同意，由专业的调查员和医生采集研究对象的血标本。

1.2 研究方法 采集研究对象空腹8 h 静脉血5 mL，于非抗凝干燥无菌真空管内静置1 h，2 000 r/min离心5 min，分离血清并分装，－80℃存储备检。ELISA 法检测2组血清DNMTs 水平，ELISA 检测试剂盒购自美国R＆D 公司，操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学处理 用Excel 2003 建立数据库，Curve Exert 1.3 进行ELISA 标准曲线拟合，直线回归分析的线性相关系数r 不低于0.95，采用SPSS 12.0 进行分析，连续性变量正态分布时应用¯x±s、非正态分布时采用中位数(上下四分位数)表示，两组间一般情况及血清DNMTs 表达水平的比较应用两独立样本t 检验或者秩和检验;定性资料组间比较用χ2检验。按3 种DNA 甲基化酶水平的百分位数25%、50%、75%为分界点分别将肺癌组和对照组分为4 层，探讨DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 表达水平与肺癌危险性的关系。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组基本情况的比较 肺癌组共136例，其中男101例，女35例，年龄(60.75±9.55)岁;吸烟者76例，不吸烟者60例;鳞癌56例，腺癌44例，小细胞肺癌32例，其他4例;临床Ⅰ+Ⅱ期共80例，Ⅲ+Ⅳ期共56例。对照组共141例，其中男107例，女34例，年龄(36.85±18.87)岁;吸烟者41例，不吸烟者100例。两组间性别差异无统计学意义(χ2=0.097，P =0.755)，年龄、吸烟史差异有统计学意义(t =13.145，χ= 181.36，P 均＜0.001)。

2.2 2组血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 表达水平比较 见表1。

2.3 性别、年龄、吸烟史对血清DNMT1、DNMT3a和DNMT3b 的影响 见表2。

表1 2组血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 表达水平比较 μg/L

表2 年龄、性别和吸烟史对3 种DNMTs 表达水平的影响 μg/L

2.4 肺癌组织学类型和临床分期对血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 的影响 见表3。

表3 肺癌患者组织学类型和临床分期对DNMTs 表达水平影响 μg/L

2.5 血清DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 表达水平与肺癌的危险性 见表4。由表4可知，随着DNMT1、DNMT3a 表达水平增加，患肺癌的危险性增加。

表4 血清DNMT1、DNMT3a和DNMT3b 表达水平与肺癌的危险性

3 讨论

DNA 甲基化是表观遗传学的重要修饰方式之一，在哺乳动物细胞基因表达的控制中具有重要的作用。DNMTs 是作用于DNA 甲基化过程的关键酶，在胚胎早期细胞分化和肿瘤发生中起重要作用［8-9］。哺乳动物的DNMTs 因结构和功能不同分为两类:一类以DNMT1 为主，参与甲基化状态的维持，与甲基化状态的延伸有关;另一类是从头甲基化酶，包括DNMT3a、DNMT3b 等［10-11］。DNA 是最稳定的生物大分子，可以轻易从体液及组织中分离，且DNA 甲基化在人类癌症中较为常见，使得DNA 甲基化标志物的检测存在较大优势［12-13］。

该研究结果显示，肺癌组患者血清DNMT1、DNMT3a 表达水平高于肺良性疾病组，经性别、年龄和吸烟史的分层分析后发现DNMT3b 差异无统计学意义。翟荣林等［14］研究发现DNMT3b mRNA 在结肠癌细胞系HT-29、Lovo 和Coca-2 中高度表达，且在不同结肠癌细胞系之间的表达水平差异有统计学意义，指出DNMT3b 在建立和维持结肠癌细胞系DNA 甲基化模式中可能起更为重要的角色。有学者［15］探讨DNMT3B 基因启动子-149C/T(C46359T)单核苷酸多态性与人群肺癌易感性的相关性发现，携带有SNP(-149C/T)C→T 转换的个体患肺癌的易感性并未明显升高，提示DNMT3b 基因C46359T多态性可能不适合作为人群肺癌易感性的一个独立风险因素。该研究结果亦表明，随着DNMT3b 表达水平增加，患肺癌的危险性并未增加，与上述结果一致。该研究中组织学类型和临床分期对3 种DNMTs 表达影响差异无统计学意义，与文献［16-17］报道肺癌组织相对癌旁组织DNMT1 的高表达与肺癌的组织学类型和恶性表型有关不一致，可能是检测标本不同，需要进一步研究血清标本与组织标本中DNMTs 表达的相关性，但DNMT1 在肺癌组织中高表达与上述文献研究结果一致。有研究［18］提示DNMT1 mRNA 过表达与宫颈鳞癌的发生发展有关，提示DNMT1 在不同肿瘤组织中表达模式可有不同。该研究中的年龄分层分析提示年龄对3 种DNMTs 在血清中的表达均无影响，但在＞40 岁组中肺癌组和对照组DNMT1、DNMT3a 表达差异有统计学意义，与文献［19］报道一致，但该研究中肺癌组和对照组年龄的差别可能会对年龄因素产生影响，有待于扩大样本量做更深研究。该研究结果对吸烟因素作分层分析，结果显示两组人群中吸烟均对3 种DNMTs 在血清中的表达无影响，与Lin 等［20］研究证实在吸烟的肺癌患者中，DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 蛋白表达明显升高不一致，其原因也可能与标本类型不一致有关，但与表4的结果提示DNMT1、DNMT3a 表达水平增加、患肺癌的危险性增加较为一致。

综上所述，DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b 高表达可能是肺癌的危险因素，检测血清DNMTs 的变化可预测患肺癌的风险。

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