肖澎，袁华伟，何桂强，杨吉蓉，吴重德，黄钧，周荣清，2

1(四川大学 轻 纺与食品学院，四川 成都，610065)2(皮革化学与工程教育部重点实验室，四川成都，610065)

4-乙基愈创木酚(4-Ethylguaiacol，简称4-EG)又名4-乙基-2-甲氧基苯酚(4-Ethyl-2-methoxy-phenol)，分子式为C9H12O2，分子量152 Da，具有烟熏及温和的烤肉味［1-3］，属酱香型香料，是一种重要的天然呈香化合物。该化合物在酱油、酒等许多食品中得到广泛应用［4-5］。通常通过以下的方法获得:(1)从天然木油中精馏;(2)由愈创木酚或香荚兰乙酮人工合成;(3)通过生物转化。精馏提取操作复杂，成本高，而人工合成所需要的反应条件比较苛刻，且因需要剧毒的锌汞参与反应，难以工业化。生物转化法具有周期短，反应条件温和，价格低廉，无污染，生产成本低等优点，已引起各国研究者的高度关注［6］。

1995年，Duncan等［7］发现了赋予酱油烟熏气味的主要原因是Brettanomyces anomalus将小麦麸皮中的阿魏酸转化为4-EG所致。Suezawa［8］探讨了Candida属酵母在含15%NaCl胁迫环境中将阿魏酸(FA)转化为挥发性酚的途径:首先FA经脱羧酶催化转化为4-乙烯基愈创木酚(4-vinyguaiacol，4-VG)，随后被还原酶催化转化为4-EG，见图1。在已发现微生物中，Pichia anomala、Pichia subpelliculosa、Debaryomyces hansenii及一些Candida属酵母及Bacillus subtilis和耐盐的Staphylococcus xylosus等细菌只是将FA转化为4-VG［9］，目前一些植物乳酸杆菌和肠杆菌可将 FA 转化为4-EG［10-13］。

图1 4-EG生物合成途径Fig．1 Biosynthetic pathway of 4-EG

在众多食品中，4-EG是特性的呈香组分，微生物的生物转化是重要的来源之一，但除了在酱油中应用的Candida属等少数种属菌株被确认外，其余的缺乏直接证据。本研究以FA为惟一的碳源，筛选到1株能高效转化FA为4-EG的分离株，根据分离株生理生化、形态的研究并结合16S r DNA序列分析鉴定其种属关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1．1．1 样品来源

酱香型大曲取自郎酒股份有限公司大曲车间。

1．1．2 培养基

①种子培养基:牛肉膏蛋白胨培养基;②筛选培养基:参见文献［14］所述方法将阿魏酸添加到VP培养基［13］中，使 FA 含量为 1g/L;③麸皮固体培养基［15］。

1．1．3 主要试剂和仪器

2-辛醇，美国Sigma-Aldrich公司;4-EG标准品，英国Alfa Aesar公司;FA，上海阿拉丁试剂有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

气相色谱-质谱联用仪:TraceDSQⅡ(Thermo Fisher公司，美国)配备毛细管色谱柱(TR-5MS，Thermo Fisher公司，美国);电泳仪:PowerPac Basic(Bio-Rad，美国);凝胶成像仪:Gel Doc XR(Bio-Rad，美国);Spectrumlab22PC可见分光光度计(Perkin ElmerTM，美国);高速冷冻离心机:TGL16M(湘麓离心机仪器有限公司，长沙);光学显微镜:CX31RTSF(Olympas，日本);Biolog全自动微生物鉴定仪(Biolog公司，美国);超声波细胞粉碎机:JY-92IIN(新芝生物科技股份有限公司，宁波)。

1.2 菌种分离及筛选

称取2 g曲粉装入含有18 mL无菌水的150 mL玻珠三角瓶中，振荡打散后，置于 80℃热处理10 min，梯度稀释后涂布于种子培养基平板上，37℃培养1 d，随机挑选单菌落经划线分离为纯菌落，接种到斜面培养基上待筛选。

初筛:分离株经活化后，分别接入筛选培养基中，振荡培养(37℃、130 r/min)6 d后，过滤发酵液，以2-辛醇作为内标，通过GC/MS检测挥发组分4-EG及4-VG的相对含量，选出转化率高的菌株进行下一步复筛。

复筛:将初筛的4-EG高转化率菌株活化，培养成种子菌悬液，接入筛选培养基中，振荡培养(37℃、130 r/min)6 d后，GC/MS检测4-EG及4-VG的相对含量。

1.3 菌株鉴定

1．3．1 菌落及菌体形态观察

复筛的目的菌株，将其菌悬液梯度稀释后，涂布于牛肉膏-蛋白胨琼脂平板上，37℃培养32h，观察菌落形态;挑单个菌落分别用光学显微镜及扫描电子显微镜观察个体形态。

1．3．2 生理生化特征

①生理生化性能检测:根据Biolog全自动鉴定仪说明书的规定程序，采用革兰氏染色阳性的细菌鉴定板进行生理生化性能测定。②耐热性研究:菌悬液分别接种到牛肉膏-蛋白胨和麸皮固体培养基中，将液态培养的温度设定为30、37、45、50和55℃，培养1 d后，比浊法检测菌体浓度。固态培养的温度设定为30、37、45、55、65 和70 ℃，培养3 d 后，涂布计数法检测菌落数量。

1．3．3 菌种16S rDNA鉴定

离心收集培养至对数生长后期的菌体，采用Bacterial DNA Kit试剂盒提取总DNA。提取得到的总DNA采用0．6%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。采用细菌通用引物(27f:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492r:5’-GGCTA CCTTGTT ACGACT T-3’)对总DNA进行PCR扩增，送至上海生工公司进行测序［16］。将测序得到的16S rDNA序列在eztaxon上进行BLAST比对后，与GenBank数据库做相似性分析。

1.4 转化特性的研究

1．4．1 筛选菌株不同组分转化性能的研究

培养至对数期的培养液经冷冻离心分离(4℃，10 000 r/min)5min，分别收集上清液和菌团，分别考察菌体及胞内外组分对4-EG转化的影响:1)以含1g/L FA的无菌水为空白样。2)用含1g/L FA的无菌蒸馏水将菌团制成菌悬液(OD600=1，pH=7);3)同2)的菌悬液，经超声处理(总时间30 min，超声时间2 s，间隔时间4 s，功率390 W)破碎细胞后加入FA使其浓度为1 g/L;4)上清液中加入FA，浓度为1 g/L;5)发酵液加入FA，浓度为1g/L。分别在37℃、130 r/min条件下培养2 d，检测4-EG的含量。

1．4．2 不同组分酶活的测定

分别考察胞内组分及胞外组分中脱羧酶及还原酶的酶活力大小，反应体系由50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7．0)和1g/L FA或者1g/L 4-VG组成，分别将1．4．1中的上清液及破壁菌液浓缩3倍，以10%(V/V)加入到反应体系中，于37℃反应1 h。反应体系中4-VG及4-EG的产量由GC/MS测定。1个脱羧酶(还原酶)酶活力单位的定义:每分钟1 μmol 4-VG(4-EG)的产量。

1．4．3 发酵温度对转化的影响

培养至对数期的培养物，调节菌体浓度为OD600=1，培养基pH=7，加入FA使其质量浓度为1 g/L，分别取50 mL装入250 mL三角瓶中，置于30℃、37℃、41℃、45℃、50℃、55℃ 培养2 d，测定4-EG的含量。

1.5 代谢产物GC/MS分析

发酵液在4°C下10 000 r/min离心5 min，收集上清液，加入5倍量的二氯甲烷及一定量的2-辛醇(内标)超声萃取15min，经分液漏斗得到有机相，重复提取2次。向有机相中加5 g无水Na2SO4，12 h，过滤，在冰浴中经氮气吹扫浓缩至0．5 mL供GC/MS检测分析［12，17］。

色谱条件:进样口温度为250℃，初始温250℃;分流模式，分流比10∶1;升温程序，初始温度80℃，保持2 min，以10℃/min升到210℃;载气:高纯氦气，流速为1 mL/min。质谱条件:连接口温度:250℃;电离方式:EI;电子能量:70 eV;离子源温度:200℃;扫描范围:40～500 amu，检出物经GC/MS标准谱库(NIST05)检索及标准品的保留时间进行鉴定。

2 结果与分析 ［D4］

2.1 4-EG产生菌株筛选

102株分离株接种到筛选培养基中，37℃、130 r/min振荡培养6 d，检测挥发性组分，以挥发性组分中的4-EG相对含量为基准，初筛的6株高产菌进行复筛，结果如表1。D-31菌株发酵液中的挥发性组分中4-VG及4-EG含量、4-EG摩尔转化率均较高。

表1 菌株复筛结果Table 1 Results of strain rescreening

2.2 菌株鉴定

2．2．1 菌落及细胞形态观察

D-31经活化后，梯度稀释涂布在牛肉膏-蛋白胨琼脂培养基上，37℃培养32 h，观察菌落形态(图2B)，菌落表面粘稠，边缘处乳白色一圈突起，类似火山口，呈不规则形态。菌体形态为杆状，单生，革兰氏阳性，产芽孢，芽孢中生，菌体形态的电镜图如图2A所示。

图2 D-31菌株形态Fig．2 Morphology of strain D-31

2．2．2 生理生化特征

采用95种碳源的革兰氏染色阳性细菌鉴定板对其生理生化性能测定，分析结果表明，该菌株与Bacillus subtilis相似度是100%，与其他菌属相似率均为0%，结合菌落、菌体形态观察结果并参考《伯杰氏系统细菌学手册》(第二版)，初步判断为Bacillus subtilis。该菌株液体培养，最适生长温度是37℃，温度在45～50℃能生长，高于55℃时，基本停止生长(图3)。固态培养，适合生长温度范围是30～45℃之间，最适温度:37℃，同样大于55℃时，停止生长，部分菌体死亡，大部分以芽孢形式存活(表2)。

图3 液态发酵D-31菌株在不同温度下的生长情况Fig．3 Effect of temperature on the growth of D-31 strain in submerged fermentation

表2 固态发酵D-31菌株不同温度的生长情况Table 2 Effect of temperature on the growth of D-31 strain in solid fermentation

2．2．3 16S rDNA 鉴定

D-31菌株16SrDNA核苷酸序列全长为1257 bp，在GenBank中登录号为KF702383，经多序列同源性分析，得到12个有100%同源性的菌株，系统发育树中D-31菌株与Bacillus subtilis(AMXN01000021)属同一分枝 (图4)，确定为 Bacillus subtilis，暂编号为D-31。

图4 菌株D-31基于16S rDNA序列构建的系统发育树Fig．4 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences of strain D-31

2.3 转化特性的研究

2．3．1 发酵液不同组分转化能力

发酵物、活菌体和上清液均能将FA转化为4-EG(图5)，但上清液的转化效率高于细胞碎片和菌体组分，而菌悬液的催化活性最高。催化组分的性质及机理需进一步研究。

图5 不同类型转化形成4-EG的情况Fig．5 Formation of 4-EG in different types

2．3．2 不同组分酶活力的测定

测定其胞内组分及胞外组分中脱羧酶及还原酶的酶活力结果如表3所示，上清液组分中的4-VG还原酶酶活力高于细胞碎片洗涤物中的。但前者的FA脱羧酶酶活小于后者，可能是胞外中间产物4-VG迅速转化为4-EG及其他代谢物，无法积累所致。该结果表明B．subtilis D-31是FA脱羧酶和4-VG还原酶共同催化FA转化为4-EG，与先前的报道一致［8］。

2．3．3 发酵温度对转化的影响

由图6可知，目的菌株转化阿魏酸生成4-EG的最适发酵温度为45℃，在30～45℃，随着温度的增加，代谢产物4-EG的产量呈递增趋势，超过45℃后，4-EG产量迅速减少。

图6 温度对4-EG转化产量的影响Fig．6 Effect of temperature on transformation of 4-EG

2.4 代谢产物分析

发酵上清液经GC/MS检测，检出19种挥发性组分，如丙酮酸甲酯、2，3-丁二醇、异丁酸、4-EG、4-VG、油酸乙酯等(见图7)，占总检出峰的56．13%。其中，酯类占0．8%，醇类占1．41%，烷烃类占2．31%，酸类占0．28%，酚类物质占51．18%。这19种挥发性组分中4-VG和4-EG所占总峰比例最高，分别为45．64%［(0．64±0．03)g/L］和5．28%［(26．38±3．39)mg/L］。

表3 不同组分酶活力测定Table 3 Enzyme activity assay from different components

图7 D-31菌株发酵液芳香组分的总离子流图Fig．7 Total ion chromatorgraphy of aromatic components in fermentation broth

3 讨论

本研究利用FA为唯一碳源的定向培养基，以挥发性组分图谱及4-EG相对含量为基准，从酱香型大曲中分离出1株具有高效转化阿魏酸形成4-EG能力的菌株。通过菌落及菌体形态观察，以及生理生化性能的结果初步鉴定为Bacillus subtilis，16S rDNA的遗传鉴定证实。对FA转化4-EG的特性的初探结果表明，参与转化作用的是胞外上清液的某些组分。虽然已有文献报道在耐盐酵母的胞外组分是以FA脱羧酶及4-VG还原酶为主的混合物质［5］，但具有转化FA为4-EG特性的Bacillus subtilis的转化机制未见报道，需要进一步研究。

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