王运照，胡文忠，李婷婷，马 堃，姜爱丽

(大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600)

冰酒(Ice wine)是一种甜型葡萄酒，被赞誉为“酒中贵妇”及葡萄酒世界的“冰美人”。从冰酒的酿制工艺上讲，完全成熟并且晚收的葡萄，会发生脱水其糖分会提高，同时，又在自然条件下冰冻，葡萄中的水分会全部凝结成冰，这样榨出的葡萄汁糖度更高，这使得冰酒中的残留含糖量从180g/L到320g/L不等，但由于其高酸度，冰酒仍然非常清爽［1］。葡萄酒中的含糖量影响葡萄酒的口感、格调风格和酒的品质［2］。加拿大、奥地利以及德国的葡萄酒工业协会就冰葡萄酒产品糖度达成国际标准:最小的天然糖分含量应该是15%，但是由于自然条件影响，可以超过这个最小量。冰酒酒体饱满、爽口、清新，甜而不腻，是不可多得的上乘佳酿。

酒中糖的定量检测分析方法主要有高效液相色谱法［3-4］、离子色谱法［5］、核磁共振波谱分析技术［6］和气相色谱法［7］，目前使用高效液相色谱法的有莫海涛［8］等人建立了同时测定低蔗糖食品中葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的高效液相色谱方法，检出限为4.5～6mg/L。鲁琳［9］等人采用测定食品中的三氯蔗糖回收率达94.3%～97.1%，精密度(n=6):1.9%～2.3%。Morenno等人［10］用HPLC测定了多种维生素药剂中5种水溶性维生素。然而目前将HPLC-ELSD方法应用于冰酒中糖类含量的分离测定相对较少，其他通用方法前处理繁琐，产生较多工作量。因此本实验利用HPLC-ELSD测定冰酒中各类糖含量，操作简单、重现性好，并可同时测定多种糖。本实验目的在于建立冰酒中糖类物质的分离测定常用方法，为鉴别真假冰酒提供参考依据，并为开发营养健康的冰酒佳酿提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

六个不同品种的葡萄酒:德国蓝白pfalz葡萄酒、辽宁本溪森奥冰红葡萄酒、张裕冰酒酒庄黄金冰谷葡萄酒、加拿大冰(红)葡萄酒、普瑞丽家族甜白葡萄酒、辽宁五女山窖藏冰葡萄酒;乙腈(色谱纯);超纯水;葡萄糖(50-99-7，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%);果糖 ，7660-25-5，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%);麦芽糖，16984-36-4，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%);蔗糖(57-50-5，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%);乳糖(63-42-3，Dr.Ehrenstorfer Gmbh，99.5%)。

高效液相色谱仪LC-10A 日本岛津;蒸发光检测器SEDEX75 日本岛津;超声波破碎仪 昆山市超声仪有限公司;色谱柱 NH2柱(5μm 4.6mm×25cm) 大连依利特科学仪器有限公司;PL203型精密电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司;旋转蒸发仪 德国IKA公司;CUM-1107超纯水机 威立雅水处理技术上海有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 NH2色谱柱(5μm，250mm×4.6mm);流动相:乙腈∶水 =80∶20;流速:0.8mL/min;蒸发光检测器温度:40℃;20μL进样。

1.2.2 试液的配制

1.2.2.1 标准溶液的配制 葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖标准溶液的配制:称取标准品10mg，用6mL超纯水溶解，超声溶解30min，定容至10mL棕色容量瓶中，配制成1g/L的标准溶液，分别稀释得到300、250、200、150、100、50、30、20mg/L 的标准溶液，摇匀，经微孔滤膜(0.45μm)过滤。

混合标准溶液的配制:将配制好的相同浓度葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖标准溶液分别混合，得到 300、250、200、150、100、50、30、20mg/L 的标准溶液，每种浓度中均含有相同浓度的五种糖含量，摇匀，经微孔滤膜(0.45μm)过滤。

1.2.2.2 样品的处理和待测溶液的制备 冰酒酒样的处理:取2.5mL酒样于25mL容量瓶，加5mL石油醚和5mL乙酸乙酯，振荡萃取15min，分离上清液，留下层液，重复三次，40℃条件下，旋转蒸发至3～5mL，加5mL水，超声溶解5min，移至10mL容量瓶，定容至10mL为待测液，0.45μm滤膜过滤，20μL进样测定。

1.2.3 结果的计算

式中:X为冰酒中各种糖分的含量，g/L;C为由标准曲线查得的样品溶液浓度，mg/L;V1为样品溶液体积，mL;n为稀释倍数;V2为试样体积，mL。

1.3 数据分析

用Excel作图，实验结果取六次测定的平均值并计算标准差，以SPSS进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

氨基柱的键合官能团氨丙基糖与糖分子上因端基异构碳上所带的羟基被去质子化而带负电荷之间相互作用使糖被保留，从而达到分离。在测量糖类含量实验中，氨基(NH2)柱有着广泛的应用基础，具有方法线性好、回收率高、重现性好和稳定性能优越等特点。张伟、王磊［11］等在其《高效液相氨基柱和C18柱测定甜菊糖含量方法对比》中对比了氨基(NH2)柱与C18柱在测量甜菊中糖含量的性能，C18柱检测结果比NH2柱低1.5%～3%。该色谱柱成功实现了葡萄糖、果糖与葡萄酒中干扰峰的基线分离。本次实验在选择以乙腈与水的混合流动相的前提下，对比了氨基(NH2)柱与C18柱在测量混合标准溶液中糖含量，C18柱检测峰行比NH2柱峰行偏低，因此本实验采用了氨基(NH2)柱作为色谱柱。

2.2 流动相及流速的选择

在相同流量下改变流动相浓度只改变被测物质的出峰时间，随着水溶液浓度减小，流动相强度也逐渐减弱，被测物质的保留时间延后，分离度有一定提高，但是浓度过小会导致峰形展宽，分离度有所下降。

流动相在乙腈∶水=80∶20时，峰形较好，且混合标准液中五种糖可以在25min之内分离开来，而乙腈∶水=75∶25时，葡萄糖和果糖所出峰无法分离开来，而乙腈∶水=85∶15时，需要40min才可以将五种糖完全分离开来。实验选择最佳的流动相为乙腈∶水=80∶20。

随着流动相流量减小，糖类的保留时间延后，峰形展宽，峰面积增大，峰高值下降。但是流量过大会导致峰形过窄难于分辨。实验选择最佳的淋洗液流量为0.8mL/min。

2.3 标准曲线的绘制及检出限

将配制好的不同浓度的混合标准溶液按1.2.1所述的色谱条件测定，六次平行进样，结果显示:在500mg/L的混合标准溶液检测时出现平头峰，在20mg/L的混合标准溶液检测时没有出现峰行，在此范围之内的混合标准溶液检测时出现了较好的峰行，本次选取了100mg/L和200mg/L的混合标准溶液在30min内的峰行曲线如图1所示。利用检测所得的各浓度混合标准溶液所出的峰行曲线并制得标准曲线，五种糖的线性范围、线性回归方程及仪器检出限见表1。

图1选取了100mg/L和200mg/L的混合标准溶液在30min内的峰行曲线。从图1可以看出，在按1.2.1所述的色谱条件测定五种糖类可以在25min内全部出峰，且效果明显。果糖出峰时间最早，在9.643min，乳糖出峰时间最晚，在22.084min。

图1 5种标准品曲线色谱图Fig.1 Chromatograms of 5 types of sugar in ice wine standard

表1 各种糖类标准曲线及相关系数Table 1 Different types of sugar in ice wine standard curve Linear and correlation coefficients

表3 六种冰酒的糖分含量测定结果Table 3 Results of sugar content determination in six types of ice wine

2.4 精密度

取200mg/L的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的标准溶液，分别连续6次平行进样，计算5种糖的保留时间及峰面积的精密度，对冰葡萄酒进行6次平行测定，葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖含量的相对标准偏差(RSD)分别为1.2%、2.1%、1.2%、1.3%、0.7%，结果见表2。

表2 方法精密度Table 2 The method of RSD

2.5 样品的测定结果

2.5.1 六种冰酒中各糖分含量测定结果 应用HPLC-ELSD法按上述色谱条件检测，并对照标准曲线，对冰葡萄酒进行6次平行测定，按1.2.3所述公式计算，将测得的数据进行统计分析，取平均值，得到六种冰酒中各糖分的含量，测定结果见表3。

经测定各种品种的冰葡萄酒糖含量范围在160～280g/L之间，主要为果糖和葡萄糖，且果糖含量大于葡萄糖含量。

德国pfalz蓝冰白葡萄酒中葡萄糖和果糖的含量比例为3∶5，葡萄糖所占比例最高，而其他冰酒葡萄糖含量所占比例相对较低，其中张裕冰酒酒庄黄金冰谷葡萄酒及辽宁五女山窖藏冰葡萄酒中葡萄糖和果糖的含量比例为1∶3，同时加拿大冰(红)葡萄酒、普瑞丽家族甜白葡萄酒中葡萄糖和果糖的含量比例也接近1∶3。此次选择的六种冰酒中，除德国pfalz蓝冰白葡萄酒之外，另五种所选冰酒原料葡萄品种均为威代尔，且葡萄糖和果糖的含量比例接近为 1∶3。

由表3可见，各种品种的冰酒总糖度相差较大，同时葡萄糖和果糖的含量相差也较大，原因可能为各种冰葡萄酒所用的原料葡萄本身所含糖分不同，在酿造过程中不同的酿酒酵母品种消耗的葡萄糖和果糖不同，同时酿酒酵母生成的酒精含量和剩余糖类也会不同，并且各地区品种冰酒酿造时间不同，酿酒酵母的选择不同，酿造工艺不同等都有可能导致这样的结果。

2.6 样品加标回收率

对葡萄酒进行加标回收率的测定，分别加入低、中、高三种浓度的葡萄糖和果糖标准溶液，按本文方法进行测定，结果见表4。

果糖的出峰时间9.643min，葡萄糖的出峰时间10.865min，六种样品的回收率在94.7%～103.4%，说明此实验方法重现性好，回收率高，性能稳定，具有可行性。

3 结论和展望

本实验建立了冰葡萄酒中糖类含量的分析方法，在流动相为乙腈∶水=80∶20，流速0.8mL/min时，成功实现了冰葡萄酒中糖类(主要为葡萄糖和果糖)含量的分离。此方法能快速定性和定量的测定糖类含量，利用各种糖分折光度不同的等特点，选择适合的色谱柱和分析条件，利用蒸发光检测器快速分析出样品中各种糖分的含量，并且，葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖五种糖分能同时测定，该方法准确度可靠，灵敏度较高，回收率在94.7%～103.4%，表明本实验建立的HPLC-ELSD法是可以快速、准确、可靠的测定水溶性糖类物质含量，大大节省了样品处理的时间和分析时间，是可以广泛使用的一种测定方法。

各品种冰酒糖分虽有差异，但找出各地区品种冰酒的糖分含量特征，冰酒酿造过程中各糖分的含量变化与酿酒酵母活性之间的关系，以及糖分变化与酒精度和香气成分之间的规律仍然可行。且糖类作为冰酒营养成分及酵母发酵过程的双功能必需品，对其研究必将对冰酒营养成分及冰酒的酿造提供有效指导和理论依据。其中各种冰酒中葡萄糖含量与果糖含量的比例特征及各成分的特征含量有可能为冰酒的鉴别提供参考依据。

表4 方法样品回收实验(n=6)Table 4 Degree of Sample recovery test(n=6)

利用本实验建立的HPLC-ELSD法可以用来检测市场上不同品质之间的各类冰葡萄酒，以期能以糖分含量将冰酒的品质优劣区别开来，并进一步测定冰酒从原料葡萄到窖藏过程中的糖类含量变化，利用高效液相色谱、质谱、核磁共振等仪器做冰葡萄酒的肽指纹图谱及精确验证冰酒中的糖分含量，这将对于快速检测冰葡萄酒的真假以及功能性保健食品的开发具有重要的意义。

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