张积广

福建省立医院胸外科，福建福州 350001

非小细胞肺癌的发病率及病死率高，对放化疗不敏感，疗效欠佳。紫杉醇是非小细胞肺癌治疗的一线化疗药物，临床应用较广泛，其抗肿瘤机制主要是通过凋亡促使肿瘤细胞死亡，而凋亡抵抗是恶性肿瘤细胞的一个重要生物学特征，严重降低紫杉醇的治疗效果，因此有效提高紫杉醇促凋亡功能，可增强其抗肿瘤作用，提高其疗效。microRNA 是单链非编码小分子RNA，其在转录后水平调控基因的表达，是肿瘤学近年研究的热点，据文献[1]报道miRNA 可改变肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。该研究起止时间为2013年1月—2014年5月，旨在阐明miR-101 促进紫杉醇诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，并探讨其可能机制，现报道如下。

1 方法

1.1 细胞培养

H358(支气管肺泡癌)和H226(鳞癌)细胞株购自ATCC，细胞株在含10% FBS、含双抗(100 IU 青霉素和100 μg/mL 链霉素)的RPMI-1640 培养液中培养。

1.2 miRNA-101mimics 和siRNA 的细胞转染

按照Lipofectamine 2000 说明书的步骤进行转染。将适当数量肺癌细胞接种于96 孔或6 孔板，细胞汇合度达到50%～60%时进行转染，转染后6 h，更换培养液为含10%FBS 的DMEM。

1.3 实时定量PCR

用Trizol 从细胞中提取总RNA。

①microRNA-101 表达检测

按逆转录试剂盒说明书将miRNA 逆转录为cDNA，将逆转录产物进行实时定量PCR 扩增，反应体系如下。

2×Real-time PCR Buffer 10 μL，miR specific Primer set(5μmol/L)0.6 μL miRNA RT product(物稀释3 倍)2 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL，dd H2O To 20 μL。混匀上述各组分，95 ℃3 min,95 ℃12 s，58 ℃40 s，40 个循环，PCR 反应在ABI 7500 荧光定量PCR 仪上完成。U6 作为内参，用2-△△ct 法计算。该实验重复3 次。

②EZH2-mRNA 表达检测

按逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA，将逆转录产物进行实时定量PCR 扩增，反应体系如下。

上、下游引物各(10 μmol/L)1 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，逆转录产物(稀释10 倍)1 μL，Add H2O to final 25 μL。将上述各部分混匀。……