胡继卫，张景华△，洪 慧，李玉凤，马 杰，陈晶晶，张顺礼，胡万宁

1.唐山市人民医院 乳腺外科（唐山 063001）；2.河北联合大学 研究生院（唐山 063009）

目前，乳腺癌已成为女性发病率最高的癌症之一，由于其病因复杂，早期诊断和早期综合治疗是防治乳腺癌最有效的手段［1］。乳腺癌是一种全身性疾病，原发肿瘤只是全身疾病在局部的表现，身体其他各处可能早已存在着微小转移灶，临床发现有些患者未见淋巴结转移，却已发现血液中有癌细胞存在［2］。乳腺癌的浸润、转移是其复发和影响其预后的重要因素，若能早期发现乳腺癌患者外周血中是否有癌细胞及其微转移倾向，对于选择适宜的治疗和准确的预后判断具有十分重要的意义［3］。线粒体融合蛋白2（mitochondria fusion protein 2，Mfn2）是一种重要的细胞增殖抑制因子，也被称为细胞增殖抑制基因（HSG）。研究［4－5］表明，Mfn2对多种肿瘤细胞系有抑制细胞增殖的作用，尤其是乳腺癌细胞株BM－1，且Mfn2抗增殖的作用明显大于肿瘤抑制基因p53。为探讨外周血Mfn2mRNA的表达对乳腺癌早期诊断的临床意义，提高乳腺癌微转移的诊断效率，本研究采用RT－PCR检测了62例乳腺癌患者外周血中Mfn2mRNA的表达，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2013年9月至2014年1月在唐山市人民医院乳腺外科住院并经芯针穿刺病理学确诊为乳腺癌的女性患者62例为研究组，年龄33～72岁，平均（48.15±7.78）岁；TNM 分期0期7例，Ⅰ期14例，Ⅱ期16例，Ⅲ期14例，Ⅳ期11例。另选25例健康志愿者为对照组，年龄27～68岁，平均（47.32±8.52）岁。所有患者取外周血时均未行手术、放疗、化疗及内分泌治疗，体质量指数（BMI）正常，且排除高血压、糖尿病等可能影响实验结果的相关疾病。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 采集患者静脉血液标本3～5mL，加入人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）分离有核细胞，Trizol A＋试剂（美国Invitrogen公司）常规提取总RNA，2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，紫外分光光度法测定浓度和纯度。

1.2.2 RT－PCR反应 PCR引物由上海生工设计合成，引物序列如下。Mfn2引物：上游引物P1：5′－AGGGACTTGCCTCTCTTCTC－3′；下游引物 P2：5′－TCCACCATCCATCCTTCTAC－3′。 GADPH引物：上游引物 P1：5′－GGGAAACTGTGGCGTG AT－3′；下游引物 P2：5′－TGGGTGTCGCTGTTGA AGT－3′。

逆转录合成cDNA：取2μg总RNA，根据逆转录试剂盒（Fermentas International公司）合成cDNA第一链，反应体系总体积为20μL。反应条件：总 RNA 2μg，Oligo（dT）1μL，加 RNasefree ddH2O至12μL，70℃水浴5min后，冰浴30s，再加入5×Reaction Buffer 4μL，RNase Inhibitor 1μL，dNTP Mix 2μL，反应混合物在37℃水浴5min，最后加入1μL Mu LV RT，42℃水浴60 min，70℃10min结束反应，－20℃冷冻保存。

RT－PCR扩增体系（总体积25μL）：cDNA 2.0μL，10μmol上游引物1.0μL，10μmol下游引物1.0μL，2×PCR Master Mix（北天根生化科技（北京）有限公司）12.5μL，ddH2O 8.5μL。PCR反应条件：94℃3min预变性，94℃45s变性，55℃30s退火，72℃1min延伸30cycles，72℃延伸7min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 免疫组化法检测组织表皮生长因子受体（EGFR）的蛋白表达 乳腺癌组织切片脱蜡至水，用枸橼酸盐煮沸法进行抗原修复，加3%H2O2作用10min消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗涤；滤纸吸干，加山羊血清工作液封闭，37℃孵育30min，滤纸吸去除封闭液；滴加用抗体稀释液稀释的一抗（北京博奥森生物技术有限公司，稀释浓度：EGFR为1∶100），对照组用PBS代替，放于湿盒中4℃过夜；PBS洗涤，滴加生物素标记的羊抗鼠二抗IgG，37℃孵育15min，PBS洗涤；滴加辣根酶标记工作液，37℃孵育15min，PBS洗涤；二氨基联苯氨（DAB）显色，在显微镜下根据颜色呈现情况掌握染色时间，并用自来水即可终止反应。再用苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封片。用已知阳性EGFR的乳腺癌切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 观察指标

观察外周血Mfn2mRNA和乳腺癌组织中EGFR的表达情况，分析外周血中Mfn2mRNA的表达与临床病理资料的相关性。

1.4 评价标准

免疫组织化学法结果判定：EGFR主要表达在细胞膜或者细胞浆中，呈棕褐色。采用阳性细胞百分比法进行半定量分析，1 000个细胞呈现的阳性细胞数结合显色强弱分为：阴性（－）不显色，弱阳性（＋）＜25%，中度阳性（＋＋）26%～50%，强阳性（＋＋＋）＞50%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT－PCR检测外周血Mfn2mRNA的表达

RT－PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果中，对照组外周血中Mfn2mRNA均为阳性表达，研究组阳性表达率为46.77%（29／62），两者比较差异有统计学意义（χ2＝21.44，P＜0.001）。研究组中0～Ⅱ期患者 Mfn2mRNA阳性表达率为64.86%（24／37），Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率为20.00%（5／25），两者比较，差异有统计学意义（χ2＝12.06，P＜0.001）（图1）。

图1 Mfn2mRNA的表达

2.2 免疫组织化学检测组织中EGFR蛋白的表达

研究组的组织标本中，EGFR阳性34例，其中外周血Mfn2mRNA阳性12例；EGFR阴性28例，其中外周血Mfn2mRNA阳性17例。EGFR阳性的乳腺癌患者中Mfn2mRNA的表达水平显著低于EGFR阴性者（P＜0.05）。Mfn2mRNA的表达与患者年龄、肿瘤大小无关，与TNM分期、淋巴结转移与否以及EGFR表达情况有关（表1、图2）。

表1 外周血中Mfn2mRNA的表达与临床病理资料的关系

3 讨论

微转移是指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝和肺等组织器官中的微小肿瘤细胞灶，直径≤1mm，常无任何临床表现，常规方法如CT、MRI和普通病理检查等难以发现［6］。微转移的肿瘤细胞常以单个细胞或微小细胞团的形式经淋巴系统、血液系统转移至淋巴结、骨髓和其他组织器官，也可以直接侵袭周围组织或种植于体腔。微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境。动物实验［7］表明，有0.01%的循环肿瘤细胞能到达下一器官并发展成显性转移。微转移是肿瘤转移、复发的基础和前提，其检测有利于判断预后和指导治疗。

血浆中富含大量的RNA酶，一旦出现RNA即会被降解，故血浆中不会有游离的mRNA。通过RT－PCR技术检测的mRNA来自外周血中完整的循环细胞，选择恰当的靶mRNA是决定检测结果是否可靠的重要因素。Mfn2又名HSG，是陈光慧等［8］利用cDNA差异显示技术得到的一个新基因，其编码产物HSG／Mfn2可通过抑制ERK／MAPK信号转导途径使细胞周期停滞在G2／M期，抑制细胞增殖［9］。研究［10］发现，Mfn2在肿瘤组织中的表达明显低于正常以及良性病变乳腺组织，且其表达水平与淋巴结转移呈负相关。

图2 组织中EGFR蛋白的表达（×400）

EGFR是原癌基因c－erbB1的表达产物，表达于各种组织上皮细胞。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥着重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。已有众多证据［11－13］表明，EGFR酪氨酸激酶受体家族在一系列恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。研究［14－15］显示，EGFR 在 肺癌、鼻咽癌、结肠癌和胰腺癌等肿瘤中均有表达。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞增殖、血管生成、黏附、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞凋亡。

本研究利用RT－PCR技术检测乳腺癌患者循环血液中的Mfn2mRNA表达情况，结果显示，乳腺癌患者中Mfn2mRNA的表达与患者年龄及原发肿瘤大小无直接关联，而与TNM分期、淋巴结转移与否及EGFR的表达情况有密切联系，提示Mfn2mRNA作为乳腺癌患者外周循环血细胞中的标志具有可行性和特异性。RT－PCR检测外周血Mfn2mRNA为临床常规检测乳腺癌微转移和预后评价等提供了依据，值得进一步研究。

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