李洪敏，王 晶，韩 琴△，刘 新，冷言冰，黄 宁

1.成都医学院 公共卫生系（成都 610083）；2.四川大学华西医学中心 感染与免疫实验室（成都 610041）

HMGN2属于高迁移率非组蛋白家族成员，是动物细胞核中含量最丰富的非组蛋白家族，具有抗病毒、细菌和肿瘤等多种微生物活性。近年来发现，它在哺乳动物的发育包括胚胎发育方面起着重要作用，故HMGN2是一类具有多功能的分子［1］。P53蛋白是一种抑癌基因，目前对其在肿瘤方面的研究比较深入，而早在上个世纪末就发现P53与胚胎发育有着紧密联系，P53基因被敲除后的胚胎小鼠在出生后会因多器官衰竭而很快死亡。有报道［2］显示，与HMGN2同一家族成员的HMNB－1可作为一个独特的活化剂调节P53基因在信号通路中的变化，但P53基因能否调节其同源蛋白HMGN2的变化尚无报道。为了观察P53和HMGN2的关系，本研究利用RNA干扰（RNAi）技术靶向稳定沉默A549细胞中的突变型P53基因，观察其对细胞中HMGN2蛋白调节的变化，以探讨P53基因和HMGN2蛋白之间的关系，为今后开展小鼠生长过程中HMGN2参与发育机制的体内研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 人肺腺癌细胞株及细胞培养

人肺腺癌细胞株A549由四川大学生物治疗重点实验室惠赠。P53－siRNA试剂盒和小鼠抗人P53抗体购至美国Santa cruz公司，胎牛血清（FBS）购自美国 HyClone公司。Trizol试剂盒、脂质体（lipofectamineTM－2000）购自美国Invitrogen公司，G418购至美国sallgon公司，小鼠抗人β－actin一抗和兔抗鼠IgG／HRP二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。P53－siRNA真核细胞转染的人肺腺癌细胞株A549作为实验组P53－si，转染空质粒的A549细胞为空白对照组con－si和未转染任何载体的A549细胞为正常对照组con。各组细胞于含10%FBS的细胞培养液DMEM中、37℃、含5%CO2温箱中培养，每组细胞的培养基加入G418（终浓度为200μg／mL）处理。

1.2 小分子干扰引物序列

P53基因的寡核苷酸的P53－siRNA序列设计并合列。实验序列为靶向P53基因的寡核苷酸，其正 义 序 列 为：5′－CUACUUCCUGAAAACAAC GdTd T－3′，反义序列为：5′－CGUUGUUUUCAGG AAGUAGdTdT－3′；对照的β－actin的正义链为：5′－GCG CGCTTTGTAGGATTCG－3′，反 义 链：5′－GGTAC CACCATGTACCCAG－3′。由上海吉玛公司合成，经测序完全正确。

1.3 细胞转染和蛋白提取

转染方法按照lipofectamineTM－2000使用说明书进行。转染24h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，分别提取各个克隆细胞的总RNA和蛋白质进行鉴定，选出干扰效果最好的克隆进行保种。分别提取稳定转染PSG－P53i和PSG－P53c的细胞总蛋白。步骤如下：用PBS缓冲液洗涤培养瓶中的细胞两遍；用细胞刮棒刮细胞，收集细胞到离心管中，1 000r／min、4℃离心5min，去上清；加入适量蛋白裂解液（预冷），或者加三去污裂解缓冲液（50mol／L pH＝8.0Tris－HCl，150mmol／L NaCl，0.1%SDS，100μg／mL 苯 甲 基 磺 酰 氟，1μg／mL Aprotinin，1%NP－40，0.5%去氧胆酸钠）40μL，超声粉碎3～4次，3～4s／次，在振荡器上强烈振荡；将裂解物在15 000r／min、4℃的条件下离心15min；将上清转移到另一个微量离心管中，－80℃冰箱保存。上述操作均于冰上进行，以避免蛋白降解。

1.4 Western blot检测P53及HMGN2蛋白的表达

提取的总蛋白经BAC法进行蛋白定量，取100 g蛋白100℃变性5min，10%SDS－PAGE电泳，将目的条带电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h，－抗4℃孵育过夜，HRP标记的二抗室温孵育2h。用LAS－4000化学发光捕获系统显色，以βactin为内参，用ImageJ2X软件扫描灰度值进行半定量分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞转染结果

实验组和空白对照组细胞转染24h后，在蓝色荧光激发下，A为实验组带荧光的siRNA细胞中发出明亮的绿色荧光，荧光强度较强，B为空白对照组无荧光，提示质粒转染效率较好，转染效率达到90%以上（图1）。

图1 荧光显微镜检测转染的A549细胞效果图

2.2 P53及HMGN2蛋白的表达

Western blot检测结果显示，实验组P53－si中P53基因表达降低，正常对照con和空白对照组con－si中的P53蛋白表达无明显变化，表明P53－siRNA对人肺腺癌A549细胞P53蛋白含量下调（图2）。沉默A549细胞中的P53基因后，实验组中P53的表达率为62%，空白对照组为98%，达到了干扰效果。Western blot检测HMGN2的结果表明，实验组P53－si中HMGN2蛋白含量较正常对照组明显下调，空白对照组con－si中HMGN2的表达有所降低。HMGN2的表达率为：实验组56%，空白对照组88%（P＜0.01）（图3）。

图2 各组细胞中P53和HMGN2蛋白的表达

图3 半定量P53和HMGN2蛋白在各组细胞中的表达含量

3 讨论

HMGN在胚胎发育的早期表达量极为丰富，对胚胎发育以及相关基因有整体调节作用［3］。Mohamed等［4］检测出HMGN2与胚胎发育的时相性有关，发现HMGN2的mRNA在大鼠胚胎和分化组织中高表达，而在成年大鼠的各组织器官中表达水平较低；将HMGN2的反义寡核苷酸注入大鼠单细胞受精卵中，检测到HMGN2蛋白在双细胞及四细胞阶段缺失，以及单细胞分裂成双细胞、双细胞分裂成四细胞胚胎会延迟。HMGN2可以作为组织或细胞在器官发生分化的标志，而对于这种分化的调节作用，具体表现为HMGN2对胚胎发育信号通路的调节作用和导致信号通路末端基因的变化［5］。有报道［2］称，HMGB－1作为其信号通路的调节因子是P53一个独特的活化剂。

P53蛋白是一种抑癌基因，定位于人类染色体17p13.1，被称为P53蛋白。目前对P53研究比较深入的是肿瘤方面［6］，而早在上个世纪末就发现P53与胚胎发育有着紧密的联系，甚至包括P63／P73的整个P53家族在人体的发育过程起着重要的作用［7－8］。P53是细胞生长周期中的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化和细胞凋亡等生物学功能有关，它可以和HMGN2同一家族成员HMGB－1中的C端结合，从而调节HMGB－1在胚胎发育中的作用。本实验显示，P53可下调A549细胞中的HMGN2表达，P53家族参与胚胎发生发育过程的功能已被肯定，HMGB－1蛋白在结构上分为两个HMG区域即A域和B域。Sourav等［2］和Rowell等［9］利用瞬态转染检测发现，C终端酸性区域和HMGB－1是促使体内P53激活的关键，并证明酸性C末端和P53能介导转录激活HMGB－1蛋白的A盒，并进一步影响下游的作用，可见P53在发育过程中的重要性，它能够作为调节因子促使HMGB－1蛋白在发育过程中发挥作用。

本研究通过小分子RNAi技术，利用siRNA沉默靶向基因P53，Western blot检测结果发现：A549细胞中HMGN2表达下调，表明P53基因可对HMGN2mRNA表达水平产生明显的抑制作用，HMGN2水平与P53呈正相关，这意味着P53基因的调控和HMGN2参与发生发育功能活性有着密切联系。根据实验结果推测，这种作用可能是P53作为HMGN2参与调节胚胎发育的激活因子，从而参与HMGN家族蛋白变化的调控途径之一。实验只通过基因沉默技术干扰了细胞中的P53基因，为下一步的动物实验研究提供了理论基础，对于动物体内P53基因是否也能参与调节HMGN2蛋白的变化有待进一步研究。

［1］Rattner BP，Yusufzai T，Kadonaga JT.HMGN proteins act in opposition to ATP－dependent chromatin remodeling factors to restrict nucleosome mobility ［J］.Mol Cell，2009，34（5）：620－626.

［2］Sourav B，Tapas TK.The acidic C－terminal domain and A－box of HMGB－1regulates p53－mediated transcription ［J］.Nucleic Acids Research，2007，31（12）：3236－3247.

［3］Deng LX，Wu GX，Cao Y，etal.The chromosomal protein HMGN2mediates the LPS－induced expression of betadefensins in mice［J］.Inflammation，2012，35（2）：456－473.

［4］Mohamed OA，Bustin M，Clarke HJ.High－mobility group proteins 14and 17maintain the timing of early embryonic development in the mouse ［J］.Dev Biol，2001，229（1）：237－249.

［5］Cao Y，Wu G，Huang N.High mobility group nucleosomal binding domain 2protein protects bladder epithelial cells from Klebsiella pneumoniae invasion［J］.Biol Pharm Bull，2011，34（7）：1065－1071.

［6］Lane DP，Cheok CF，Lain S.p53－based cancer therapy［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2010，2（9）：1222.

［7］Danilova N，Sakamoto KM，Lin S.p53family in development［J］.Mech Dev，2008，125（11－12）：919－931.

［8］罗兰，张闻，张彦，等.P53基因在小鼠睾丸发育过程中的表达规律［J］.昆明理工大学学报，2011，36（2）：56－61.

［9］Rowell JP，Simpson KL，Stott K.HMGB1－facilitated p53DNA binding occurs via HMG－Box／p53transactivation domain interaction，regulated by the acidic tail［J］.Structure，2012，20（12）：2014－2024.