杨 锐，徐阿晶，刘 艳，陆晓彤，张 健，卜书红（上海交通大学医学院附属新华医院药学部，上海200082）

［本文编辑］阳凌燕

肝癌是最常见、恶性程度很高的肿瘤之一。目前，以手术为中心的综合治疗是肝癌病人的首选治疗方式，但是肝癌的5年术后总体生存率仍不足50%，其中转移是导致该病预后不佳的主要原因之一。寻找新的、有效的术后治疗药物是肝癌治疗亟待解决的重要问题。

N－花生四烯基乙醇酰胺（arachidonyl ethanolamide，AEA）是一种内源性大麻素（cannabinoid，CB），可通过结合CB1和CB2等受体发挥镇痛、舒张血管、抑制细胞增长和促进凋亡等生理作用［1］。研究发现，外源性给予AEA可显著抑制肝癌细胞生长，促进肝癌细胞凋亡［2］。但由于AEA在体内代谢迅速，作用效果微弱，不能满足临床治疗需要［3］。脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）是体内AEA的主要代谢酶，FAAH抑制剂URB597可间接上调体内AEA水平，并通过诱导凋亡、抑制肿瘤细胞迁徙及血管生成等发挥抗肿瘤作用［4］。目前有关URB597抗肝癌作用的报道尚少。作者采用人肝癌细胞系MHCC97H为靶细胞，通过体外实验探索URB597对肝癌的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株及试剂 肝癌细胞系MHCC97H购自中国科学院上海细胞库。DMEM高糖培养基（美国GibcoBRL公司），丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（Akt）、磷酸化Akt（p－Akt）、甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗、羊抗兔二抗、URB597（美国Cell Signaling Technology公司），MTT细胞增殖试剂盒（碧云天生物科技研究所，编号C0009）。

1.2 仪器 3111恒温细胞培养箱（美国Thermo公司）；超净工作台（美国Nuaire公司）；DFC420倒置显微镜（德国Leica公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）；5804R高速离心机（美国Effendorf公司）；酶标仪（美国SunRISE TECAN公司）；Las3000曝光机（美国GE公司）。

1.3 细胞培养 MHCC97H细胞采用DMEM高糖培养基（含10%胎牛血清，青霉素和链霉素各200IU／ml）于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA消化细胞，1∶3传代。

1.4 MTT法检测细胞活性 药物处理结束后，每孔加入5mg／ml MTT溶液20μl，继续培养4h。弃上清液，每孔加二甲亚砜（DMSO）100μl，振荡10min，选择490nm波长测定各孔吸光度（A）。

1.5 Transwell细胞侵袭实验 4℃下，用无血清培养基稀释 Matrigel胶（1∶5），Transwell培养板上室每孔加入100μl，覆盖整个膜，37℃下放置30min，使Matrigel聚合成胶。Transwell培养板下室加入10%DMEM高糖培养基，将MHCC97H细胞饥饿12h后，制成单细胞悬液，分别加入24孔板内，每孔接种1×104个细胞，设6个复孔。培养48h后，用4%甲醛固定30min，Giemsa染液染色15min，擦净上室细胞后，晾干封片。在高倍镜（×400）下随机取6个视野计数，取平均数。重复实验3次。

1.6 蛋白质印迹（Western－blot）实验检测p－Akt和Akt表达量变化 药物处理结束后弃去培养液，加入适量蛋白质裂解液，收集至预冷的1.5ml离心管中；4℃下1.34×104×g离心20min。取上清液，用BCA法检测蛋白质浓度，100℃下蛋白质变性5min。制备聚丙烯凝胶，60V电泳至分离胶，电压转至80V继续电泳2h。冰浴转膜：100V／1～2h。用5%脱脂奶粉室温下封闭1h。加一抗杂交，磷酸盐缓冲液洗膜3次；加二抗杂交，磷酸盐缓冲液洗膜3次。采用增强化学发光（ECL）试剂显影，Las3000曝光机曝光。

2 结 果

2.1 URB597对 MHCC97H细胞的生长抑制作用 MTT实验测得不同时间点的吸光度见表1。结果显示，与对照组相比，随着干预时间增加，不同浓度URB597对MHCC97H细胞生长具有显著抑制作用，且呈时间、剂量依赖性。采用流式细胞仪检测发现，1、5μmol／L URB597没有诱导MHCC97H细胞凋亡的作用；10μmol／L URB597作用3d后显示出明显的凋亡规律，但坏死率均＜2%，与对照组（坏死率 1.46%）相比，没有统计学差异。10μmol／L URB597作用3、4、5、6、7d后，细胞凋亡率分别为（18.14±3.23）%、（25.46±4.68）%、（37.56±3.69）%、（45.75±6.58）%、（53.26±5.48）%，与对照组细胞凋亡率（5.20±3.88）%相比，差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.2 URB597对 MHCC97H细胞侵袭能力的影响 Transwell实验结果（见图1）显示，URB597可显著抑制MHCC97H细胞的侵袭能力，平均镜下视野计数，与对照组（1 7±4.5 0）个相比，1μmol／L URB597组为（15±3.45）个（P＞0.05），5μmol／LURB597组为（10±2.64）个（P＜0.01）、10μmol／L URB597组为（8±1.32）个（P＜0.001，n＝6），呈显著剂量依赖作用。

表1 不同浓度URB597作用于MHCC97H细胞后不同时间测得的吸光度Table 1 The absorbance of MHCC97Hcells after treatment with different concentrations of URB597at different time（n＝6，）

表1 不同浓度URB597作用于MHCC97H细胞后不同时间测得的吸光度Table 1 The absorbance of MHCC97Hcells after treatment with different concentrations of URB597at different time（n＝6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，与对照组比较

9±0.17 2.75±0.12 2.69±0.22 1μmol／L URB597组 0.31±0.11 0.56±0.15 1.19±0.12 1.65±0.16 1.95±0.14＊2.11±0.17＊2.01±0.20＊5μmol／L URB597组 0.28±0.12 0.41±0.09 0.93±0.16＊1.09±0.13＊＊1.23±0.17＊＊＊1.58±0.14＊＊＊1.39±0.17＊＊＊10μmol／L URB597组 0.32±0.06 0.51±0.14 0.79±0.15＊＊0.96±0.09＊＊＊1.08±0.21＊＊＊0.96±0.12＊＊＊0.68±0.09 0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d对照组 0.34±0.08 0.62±0.13 1.28±0.21 1.75±0.18 2.3组别＊＊＊

图1 不同浓度URB597对MHCC97H细胞侵袭能力的影响（×400）Figure 1 Effects of different concentrations of URB597on invasion of MHCC97Hcells（×400）

2.3 URB597对MHCC97H细胞生长相关分子的影响 磷脂酰肌醇－3激酶（phosphatidylinositol－3 kinase，PI3K）／Akt通路的过度活化与人肝癌细胞增殖和侵袭密切相关［5］。不同浓度URB597处理后，以GAPDH 为内参照，对照组及1、5、10μmol／L URB597处理组p－Akt表达量分别为（81±11.25）%、（74±10.08）%、（55±5.23）%和（39±8.19）%，Akt表达量分别为（105±3.45）%、（97±7.32）%、（96±6.94）%和（102±1.69）%，如图2所示。可见，与对照组相比，URB597干预MHCC97H细胞24h后，5、10μmol／L URB597组MHCC97H细胞中p－Akt水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01），而Akt水平无显著变化，提示URB597可显著抑制Akt活化水平。

图2 不同浓度URB597处理24h后MHCC97H细胞中Akt和p－Akt的表达水平Figure 2 Expression levels of Akt and p－Akt in MHCC97Hcells after treatment with different concentrations of URB597at 24h

3 讨 论

FAAH为AEA的主要代谢酶，已成为抗癌药物研究的重要靶点，抑制其活性可显著增加内源性AEA水平，发挥抗肿瘤作用。URB597属于不可逆性FAAH抑制剂，可以显著抑制黑素瘤、神经胶质细胞瘤的生长，并抑制前列腺癌细胞侵袭［6－8］，但其对肝癌作用的报道尚少。

本研究将不同浓度URB597与MHCC97H细胞共同孵育1～7d，结果发现各浓度URB597均对肿瘤细胞具有明显的生长抑制作用，且10μmol／L URB597还可诱导 MHCC97H细胞凋亡。5、10μmol／L URB597作用2d即表现出生长抑制作用，在第4～6天可明显抑制细胞生长，1μmol／L URB597在第4天表现出生长抑制作用。1、5μmol／L URB597没有诱导MHCC97H细胞凋亡的作用，而10μmol／L URB597作用3d后显示出明显的凋亡规律，提示URB597抑制肿瘤细胞生长及促进肿瘤细胞凋亡的作用呈时间及剂量依赖性。

诸多报道显示，AEA对多种肿瘤具有抑制转移及侵袭的作用，可通过调节局部黏着斑激酶磷酸化、基质金属蛋白酶抑制因子及RhoA／Rho激酶信号通路抑制黑素瘤、乳腺癌及前列腺癌的转移和侵袭。最近研究发现，FAAH的表达和活性与肿瘤的侵袭性密切相关［8］。本研究采用Transwell实验发现，5、10μmol／L URB597可显著减少透过人工重组基底膜的侵袭细胞数，提示URB597具有抑制肝癌细胞侵袭的作用。

PI3K是脂质激酶家族的成员，Akt是其重要的下游靶蛋白。Akt为丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，PI3K可将Akt磷酸化为活性形式p－Akt［5］。PI3K／Akt通路的活化与肿瘤细胞的增殖、浸润和转移密切相关。为了进一步研究URB597对肝癌细胞系生长和侵袭能力抑制作用的机制，作者对细胞p－Akt进行检测。结果显示，URB597可剂量依赖性地抑制p－Akt水平（P＜0.05）。p－Akt可通过调节Bcl－2家族蛋白质及基质金属蛋白酶9（MMP－9）促进细胞生长和侵袭，相反，p－Akt水平降低，可以导致细胞侵袭能力的下降［9］。因此，URB597可能通过抑制PI3K／Akt通路，抑制肿瘤细胞生长及侵袭。

本研究结果初步表明，URB597对人肝癌细胞株MHCC97H细胞有抑制生长、诱导凋亡和减少侵袭的作用，可能与其抑制Akt过度磷酸化有关，提示URB597可能会成为一种新的治疗或辅助治疗肝癌的药物。

［1］Grimaldi C，Capasso A.The endocannabinoid system in the cancer therapy：an overview［J］.Curr Med Chem，2011，18（11）：1575－1583.

［2］王艳红，周小芸，张 哲，等.内源性大麻素诱导人肝癌细胞MHCC97H凋亡中Caspase－3的作用［J］.中华实验外科杂志，2010，27（2）：153－155.Wang YanHong，Zhou XiaoYun，Zhang Zhe，etal.Apoptosis induction of anandamide in a human hepatocellular carcinoma cell line with highly metastatic potential（MHCC97H）［J］.Chin J Exp Surg，2010，27（2）：153－155.In Chinese with English abstract.

［3］Willoughby K A，Moore S F，Martin B R，etal.The biodisposition and metabolism of anandamide in mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，1997，282（1）：243－247.

［4］Petrosino S，Di Marzo V.FAAH and MAGL inhibitors：ther－apeutic opportunities from regulating endocannabinoid levels［J］.Curr Opin Investig Drugs，2010，11（1）：51－62.

［5］Zhou Q，Liu V W，Yeo W.Targeting the PI3K／Akt／mTOR pathway in hepatocellular carcinoma［J］.Future Oncol，2011，7（10）：1149－1167.

［6］Hamtiaux L，Masquelier J，Muccioli G G，etal.The association of N－palmitoylethanolamine with the FAAH inhibitor URB597 impairs melanoma growth through a supra－additive action［J］.BMC cancer，2012，12：92.

［7］Hamtiaux L，Hansoulle L，Dauguet N，etal.Increasing antiproliferative properties of endocannabinoids in N1E－115neuroblastoma cells through inhibition of their metabolism［J］.PloS One，2011，6（10）：e26823.

［8］Endsley M P，Thill R，Choudhry I，etal.Expression and function of fatty acid amide hydrolase in prostate cancer［J］.Int J Cancer，2008，123（6）：1318－1326.

［9］Qin H，Du X，Zhang Y，etal.Platycodin D，a triterpenoid saponin fromPlatycodongrandiflorum，induces G2／M arrest and apoptosis in human hepatoma HepG2cells by modulating the PI3K／Akt pathway［J］.Tumour Biol，2014，35（2）：1267－1274.