李 妍，李 锋，许 晖

(1.蚌埠学院 食品与生物工程系，安徽 蚌埠 233030;2.南京军区总医院 血液科，江苏 南京 210002)

荷叶系睡莲科莲属植物莲NeLumbo nuciferaGaertn的干燥叶[1].相关研究表明，荷叶内的黄酮具有调血脂活性，其减肥降脂作用越来越受到人们的重视[2].黄酮类物质具有抗病毒、抗菌、抑制癌细胞等多种药理活性，对治疗心血管等疾病有重要意义[3].然而，多数黄酮类物质均存在难溶于冷水且不稳定的问题，这就使其应用受到限制.微囊化技术改变了物态、体积和质量;降低了挥发性并进行控制性释放;隔离活性成分，保护敏感物质[4-7].本实验采用啤酒酵母细胞对荷叶总黄酮进行包埋，实现其微胶囊化.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荷叶采自蚌埠市怀远县;芦丁标准品(中国生物制品检定所);95%乙醇(上海振企化学试剂有限公司);酵母浸粉(北京索莱宝科技有限公司);蒸馏水(蚌埠学院实验室制造);蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、硫酸、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为国产分析纯.

1.2 仪器与设备

722 可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);FA214 电子天平(上海衡器总厂);XFB-200 高速中药粉碎机(吉首市中诚制药机械厂);725N 紫外可见光分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);HH-1 恒温水浴锅 (江苏省金坛市荣华仪器有限公司);电热鼓风干燥箱 (上海一恒科学仪器有限公司);离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司);旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司);THZ-103B 恒温震荡培养箱(广州沪瑞明仪器有限公司);SB-25-12DT 超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司).

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制[8，9]

采用NaNO2-Al (NO3)3-NaOH 显色法.即准确称取20 mg 芦丁标准试剂，用50%乙醇溶液定溶至100 mL，摇匀，得浓度为0.2 mg/mL 标准溶液;准确吸取芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mL 于8只25 mL 容量瓶中，然后分别加入1 mL 5% NaNO2，放置6 min，加入1 mL 10% Al (NO3)3，摇匀，放置6 min，加入10 mL 4% NaoH 50%乙醇定容至刻度，摇匀，放置10 min 后，在510 nm 处测定其吸光度.以吸光度A 对芦丁浓度作图，得标准曲线.

1.3.2 包埋率的计算法[10]

准确称取荷叶总黄酮的量为M.由于不能直接对包埋的荷叶总黄酮进行测定，故可以通过测定未被包埋的荷叶总黄酮的含量(X)，间接换算出被包埋的荷叶总黄酮的量(M-X).则包埋率为:(M-X)/M.X的测定方法为:将包埋后的悬液测定其在510 nm处的吸光度，再将吸光度代入荷叶总黄酮标准曲线回归方程中计算出荷叶总黄酮的含量，即为X.

1.3.3 荷叶总黄酮的提取

称取荷叶1 g，采用80%乙醇浓度，调节pH值为9，超声提取时间45 min，抽滤，旋转蒸发，真空干燥24 h[2].

1.3.4 荷叶总黄酮微胶囊的制备

酵母细胞经过5次水洗过后，加20倍的5%氯化钠溶液，置于锥形瓶中，放入54℃，150 r/min 摇床中进行质壁分离24 h，再次4 200 r/min 离心10 min，经5次水洗后，放置-80℃冰箱中冷冻2 h，最后放在冷冻干燥机上干燥24 h.

将荷叶总黄酮和酵母细胞按不同的芯材比加入锥形瓶中，并加入一定体积的蒸馏水，混合均匀后，放入恒温振荡培养箱中.恒温恒速振荡一定时间后，利用渗透扩散作用使荷叶总黄酮可进入酵母细胞内部，从而形成微胶囊.混合溶液在4 200 r/min 离心10 min后，将上层清液缓慢倒出，下层细胞用蒸馏水洗涤，将未包入的荷叶总黄酮除去，冷冻干燥24 h 后，得包埋物.

1.3.5 包埋单因素试验

1.3.5.1 包埋时间对包埋效果的影响

准确称取荷叶总黄酮1.00 g，将料液比确定为1∶6，芯材比为1∶3，温度为40℃，包埋时间分别设为4、5、6、7、8 h.平行3次，按照1.3.4 操作，制备微胶囊.

1.3.5.2 料液比对包埋效果的影响

准确称取荷叶总黄酮1.00 g，将包埋时间确定为6 h，芯材比为1∶3，温度为40℃，料液比分别设为1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8.平行3次，按照1.3.4操作，制备微胶囊.

1.3.5.3 芯材比对包埋效果的影响

准确称取荷叶总黄酮1.00 g，将包埋时间确定为6 h，料液比为1∶6 温度为40℃，芯材比分别设为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5.平行3次，按照1.3.4操作，制备微胶囊.

1.3.5.4 温度对包埋效果的影响

准确称取荷叶总黄酮1.00 g，将包埋时间确定为6 h，料液比为1∶6，芯材比为13 温度分别设为20、30、40、50、60℃.平行3次，按照1.3.4 操作，制备微胶囊.

1.3.6 正交试验

根据单因素实验设计正交试验因素水平表.研究包埋时间 (A)、料液比 (B)、芯材比 (C)和温度(D)4个因素对荷叶总黄酮微胶囊制备的影响.正交因素水平表见表2-1.

表1 正交试验因素水平表

1.3.7 统计学处理

采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，数据以x ±s表示，统计学推断采用单因素方差分析[10].

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

在波长510 nm 处，测定不同质量浓度的芦丁标准品溶液在显色反应后的吸光度值，结果见图1.由图1可知，标准曲线回归方程为A =16.61C-0.0028，相关系数R2=0.9994，表明二者线性关系良好[10].

2.2 单因素试验

2.2.1 包埋时间对包埋效果的影响

由图2可知，随着包埋时间的延长，荷叶总黄酮的包埋率先增加后减小，在包埋时间6 h 处出现最高点.包埋率并未随时间的增加而增加，可能是由于过长时间的振荡，反而阻止微胶囊的形成，而且对荷叶总黄酮微胶囊产生破坏作用.

2.2.2 料液比对包埋效果的影响

图1 芦丁标准曲线

由图3可知，在料液比为1∶7 包埋率随着料液比的增大而增加，之后料液比增加包埋率反而下降.这种现象表明，过多的溶剂对荷叶总黄酮微胶囊的形成并非有利，反而影响了包埋的效果.

2.2.3 芯材比对包埋效果的影响

由图4知，在被包埋物质量不变的情况下，不断地加大壁材酵母细胞的质量，包埋率先稳定上升后缓慢下降.造成这种现象的原因可能是由于随着壁材的增多，壁材分子之间相互作用，降低了壁材对包埋物的包埋效果，从而导致了包埋率的降低.

图2 包埋时间对包埋效果的影响

图3 料液比对包埋效果的影响

2.2.4 温度对包埋效果的影响

图4 芯材比对包埋效果的影响

由图3-4可知荷叶总黄酮微胶囊的包埋率随着温度的升高先升高后降低，在50℃处出现最高峰.这种现象的出现可能是因为随着温度的升高，分子结构遭到破坏了或是水分蒸发速度太快，导致壁材成膜性降低.结果表明包埋温度并不是越高越好，而是只有在合适的温度下包埋效率可达到最高，微胶囊效果最好

图5 温度对包埋效果的影响

2.3 正交试验结果

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

由表2、表3可以得出，各因素的主次为D ＞A ＞B ＞C，最佳组合为A2B2C1D2.即影响荷叶总黄酮微胶囊化的主要因素为:温度＞包埋时间＞料液比＞芯材比.荷叶总黄酮包埋的最佳条件为:包埋时间6 h，料液比为1∶7，芯材比为1∶2，包埋温度为50℃，包埋率可达到30.4%.

2.4 验证试验

参考最佳微胶囊化条件:包埋时间6 h，料液比为1∶7，芯材比为1∶2，包埋温度为50℃，共进行3次验证试验，测得荷叶总黄酮包埋率分别为30.2%、31.1%和30.4%，平均为(30.4 ±0.17)%，因此采用此包埋优化条件参数准确可靠.

3 讨论

本实验采用啤酒酵母细胞对荷叶总黄酮进行包埋，最佳包埋条件为:包埋时间6 h，料液比为1∶7，芯材比为1∶2，包埋温度为50℃.由验证试验结果显示在此条件下荷叶总黄酮微胶囊化的包埋率可达到30.4%.本实验中使用恒温振荡培养箱，通过振荡使荷叶总黄酮微胶囊化的方法远优于文献报道其它方法，具有一定的应用价值.

[1]钟地长.天然产物总黄酮的提取、纯化及其金属配合物的研究进展[J].化学世界，2006，(9):561.

[2]李妍，李锋，许晖.不同提取方法对荷叶总黄酮含量的影响[J].蚌埠学院学报，2013，2 (2):18-21.

[3]张世东，王建建，王霞，等.玉米须单体成分纯化及类别鉴定[J].福建分析测试，2007，16 (3):67-70.

[4]Sébastien Gouin.Microencapsulation:industrial appraisal of existing technologies and trends[J].Trends in Food Science ＆ Technology，2004，15 (7):330-347.

[5]韩薇妍，赵有玺，龚平，等.微胶囊结构与性能的研究进展[J].中国生物工程杂志，2010，30 (1):104-110.

[6]许燕侠，赵亮，刘挺，等.微胶囊的制备技术[J].上海化工，2005，30 (3):20-24.

[7]徐炽焕.微胶囊的制备及其应用[J].化工新型材料，2005，33 (11):75-78.

[8]黄晔，龙光锦，姜林华，等.玉米须总黄酮的提取及鉴别[J].时珍国医药，2006，17 (6):1008-1009.

[9]刘世民.洋葱中黄酮类物质的提取与研究[J].食品研究与开发，2004，25 (2):43-45.

[10]李妍，李锋，陶志杰，等.玉米须总黄酮微胶囊化及稳定性的研究[J].中国酿造，2014，33 (4):47-51.