冯 静，霍 琰，李红艳，李季滨

(河北省人民医院，河北石家庄050051)

子痫前期是妊娠期特发性疾病，以妊娠20周后出现高血压、水肿、蛋白尿为主要临床特征，可伴有全身多脏器功能损伤。该病病因不明，除终止妊娠外，临床缺乏有效的治疗方法，严重威胁母儿生命。母胎界面是胎盘与母体直接接触的唯一部位，包括胎盘、胎盘附着处的底蜕膜及胎盘侵袭的子宫肌层。母胎界面蜕膜细胞、胎盘滋养细胞的生物学功能的改变，有可能导致了病理妊娠的发生。近年来“胎盘浅着床”理论逐渐被许多学者认为是子痫前期发病的根本原因，理论认为滋养细胞对子宫螺旋动脉侵蚀不足致使胎盘植入过浅，血流灌注不足，引起系统性的血管内皮损伤，从而导致子痫前期临床症状出现［1］，胎盘娩出后临床症状逐渐消失。因此母胎界面成为研究子痫前期发病的焦点。近期研究发现，脂肪组织分泌的内脂素(visfatin)可结合并激活胰岛素受体，模拟胰岛素的生物功能参与糖脂代谢;内脂素能促进血管平滑肌细胞成熟，参与血管生成、炎症反应、细胞分化及凋亡过程，与动脉粥样硬化及血管内皮损伤关系十分密切［2］。胚胎植入受很多因素的调节，包括子宫内膜细胞外基质降解和滋养层细胞对内膜的侵入。胚胎的滋养层细胞侵入子宫，将胚胎黏附于子宫内膜上，侵入血管内皮使母体血管重建，从而满足胎盘的血流供应［2］。基质金属蛋白酶(MMPs)是参与子宫内膜细胞外基质降解的关键酶，主要由滋养细胞分泌，可溶解细胞外基质，克服浸润过程中的3个生理屏障(基底膜、蜕膜外间质、子宫动脉腔面细胞衣)，最终蜕膜动脉内皮被血管滋养细胞取代，母体的血液流向胎盘，使高阻力低容量的血管转化为高容量低阻力的血管，因此MMPs在胚胎着床与血管重建过程中发挥重要作用。研究母胎界面的内脂素、MMPs与子痫前期的关系是本课题研究的重点。

1 临床资料

1.1 一般资料 选择2012年1月—2013年5月在本院并行剖宫产结束妊娠的子痫前期患者40例，年龄24～43(28．7±3．2)岁，孕周 32 ～40(34．7 ± 1．6)周，均符合《妇产科学》［3］中的妊娠期高血压疾病诊断及分类标准。分为轻度子痫前期组20例，重度子痫前期组20例，排除有糖尿病、原发性高血压和心、肝、肾病史者，感染、胎膜早破者。另选同期住院的正常孕妇40例作为对照组。3组均为单胎妊娠，年龄、孕周、体质量指数、基础血压比较差异无统计学意义，见表1。

表1 3组临床特征比较(±s)

表1 3组临床特征比较(±s)

组别 n 年龄/岁 孕周/周 体质量指数/(kg/m2对照组)40 25．4 ±3．2 38．4 ±1．2 25．2 ±1．3子痫前期轻度组 20 27．2 ±3．4 37．1 ±2．2 26．5 ±1．6子痫前期重度组20 28．3 ±4．5 34．4 ±2．4 27．1 ±1．2

1.2 方法

1.2.1 标本采集 胎盘娩出后立即剪取胎盘中央母体面约1．0 cm×1．0 cm×1．0 cm的胎盘组织，避开钙化灶和机化灶，所有组织取材后立即用生理盐水漂洗掉血液，放于10%甲醛液中固定，石蜡包埋，切片机连续切片。

1.2.2 检测方法 采用免疫组化(S－P)法检测内脂素、MMP－2、MMP－9的表达(兔抗人单克隆抗体来自北京博奥森公司)。石蜡切片常规脱蜡，切片抗原热修复，3%H2O2水孵育10 min，PBS液冲洗，分别滴加内脂素、MMP－2、MMP－9一抗，37℃孵育30 min，PBS液冲洗，滴加二抗，室温孵育30 min，PBS液冲洗，使用DAB溶液显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，中性树脂封片。

1.2.3 图像采集与分析 采用(日本Olympus)显微镜进行图片采集，每个研究对象随机选一张切片，高倍镜下(×400)随机选择5个视野。胞膜、胞浆、胞核内有棕黄色沉淀，高于背景染色，镜下结构清晰为阳性细胞。每一个视野数100个蜕膜上皮细胞或滋养细胞，算出阳性细胞百分比。＜10%为0分，10% ～45%为1分，46% ～70%为2分，＞70%为3分;同时判定细胞染色强度:不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据2项评分之和，将内脂素、MMP－2、MMP－9结果分为4级:0分为阴性(－)，2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性，5～6分为强阳性。采用Image－proplus5．0软件分析系统测定图片积累光密度值，取平均值，并对数据进行统计分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17．0统计软件进行分析，各组间比较用均数±标准差(±s)，采用方差分析、t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 内脂素、MMP－2、MMP－9在胎盘中表达的定量分析对照组内脂素在滋养细胞、蜕膜上皮组织、间质及血管中均有表达。子痫前期组内脂素主要在绒毛滋养细胞的包膜、胞浆中呈阳性表达。对照组MMP－2、MMP－9在滋养层细胞的胞浆及胞膜上呈阳性表达，MMP－2、MMP－9在子痫前期组胎盘组织中滋养细胞着色较浅，与对照组比，内脂素在子痫前期轻度组的光密度值增加(P＜0．05)，在子痫前期重度组增加的则更明显(P＜0．01)。MMP－2、MMP－9在子痫前期轻度组的光密度值降低(P＜0．05)，在子痫前期重度组的光密度值降低的更为明显(P＜0．01)，经单因素方差分析，各组的免疫组化光密度值差异均有统计学意义。见表2。

表2 3组胎盘中内脂素、MMP－2、MMP－9的表达水平(±s)

表2 3组胎盘中内脂素、MMP－2、MMP－9的表达水平(±s)

注:①与对照组比较，P＜0．05;②与对照组比较，P＜0．01;③与子痫前期轻度组比较，P＜0．05。

组别 n 内脂素MMP－2 MMP－9对照组40 0．35 ±0．05 0．21 ±0．02 0．19 ±0．01子痫前期轻度组 20 0．43±0．01① 0．16±0．02① 0．15±0．01①子痫前期重度组 20 0．52 ±0．01②③ 0．13 ±0．02②③ 0．13 ±0．01②③

2.2 内脂素、MMP－2、MMP－9在胎盘中的表达及相关性对照组及子痫前期组胎盘组织中内脂素、MMP－2、MMP－9的表达经 Spearman相关性分析显示，内脂素与 MMP－2、MMP－9之间存在负相关性，相关系数r分别为－0．521 0(P＜0.001)、－0．463 1(P＜0．001)。MMP－2与 MMP－9之间存在着正相关性，其相关系数r为0．381 2(P＜0．001)。

3 讨 论

子痫前期是妊娠期的特发性疾病，严重危及母婴健康，是孕产妇和围生儿死亡的主要原因，其病因目前尚不清楚，有诸多学说如胎盘浅着床、血管内皮细胞受损、免疫、遗传、胰岛素抵抗、营养缺乏等。

目前研究发现脂肪组织是人体最大的内分泌器官，脂肪细胞因子可分泌多种生物活性物质，形成代谢－神经内分泌－免疫网络，应对各种代谢问题。内脂素是近年研究较多的脂肪细胞因子，其主要在内脏脂肪组织中表达，以3种形式存在:与烟碱胺转磷酸核糖基酶抑制剂结合，与烟碱单核苷酸结合或游离存在。内脂素具有类胰岛素活性，参与糖脂代谢，促进脂肪的形成与分泌，其在血浆中的含量与内脏脂肪的多少呈正相关，肥胖与高血压病、高血脂症常同时并存［4］。内脂素可作用于血管，促进动脉粥样硬化。前B细胞集落促进因子可通过调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖蛋白脱乙酰基酶Sir2的活性，促进血管平滑肌细胞分化成熟。敲除内脂素基因能增加血管平滑肌细胞的凋亡，降低其收缩能力，为高血压是氧化还原反应改变血管结构的分子机制提供了新线索。

内脂素的主要生理功能有:①调节糖脂代谢。内脂素能结合并激活胰岛素受体，发挥类似胰岛素样的降糖作用［5］，内脂素与胰岛素受体结合的位点与胰岛素与胰岛素受体结合的位点不同。内脂素与胰岛素受体结合后激活胰岛素的传导通路，加强肌肉、脂肪组织对葡萄糖的转运，抑制肝糖释放。在血糖调节上内脂素也起重要作用，如果内脂素的生物合成或信号传递发生异常可导致疾病发生。②促进血管平滑肌细胞成熟，调节血管的氧化应激状态，改变高血压时的血管重构［6］。③参与炎症反应和免疫调节过程。内脂素作为一个内源性炎症因子，与免疫细胞的物质代谢、信号传导、组织修复炎症抑制、获得性免疫激活、凋亡等生理过程的关系非常密切［7］。④参与血管形成和动脉粥样硬化。内脂素能诱导血管生成，参与血管生成紊乱。内脂素通过激活磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、细胞外信号调节激酶等途径，调节人脐静脉内皮细胞的金属蛋白酶的基因表达。⑤内脂素基因还可能是一种新的缺氧诱导基因，子痫前期机体处于缺氧状态，胎盘中内脂素mRNA表达增加，参与子痫前期发生、发展［8］。

MMPs是1994年在小鼠胚胎发育中的破骨细胞内发现的，其作用底物为层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、Ⅴ型胶原、Ⅰ型胶原、Ⅴ型明胶及弹性蛋白。应用MMPs的特异性抗体及金属蛋白酶抑制剂能完全抑制细胞滋养细胞的侵蚀性。Ⅳ型胶原是内皮细胞基底膜所特有，由此可见MMPs在滋养细胞的侵蚀及血管重铸中发挥着重要的作用。绒毛外滋养细胞侵入母体分为3个阶段:第一阶段是细胞和细胞外基质的黏附，第二阶段是着床部位细胞外基质极性的降解，第三阶段是穿透细胞外基质。其中第二阶段需要能够降解细胞外基质的酶类，而细胞外基质的降解必须要有MMPs的参与。滋养细胞侵袭的限速步骤是MMPs系统对细胞外基质的降解，因此MMPs在滋养细胞的侵蚀和胎盘血管床重铸过程中发挥着重大作用。并且MMPs与其拮抗剂TIMP－1共同严格调控着滋养细胞侵蚀的过程，使滋养细胞的侵蚀不会过深或过浅。正常孕妇胎盘上螺旋动脉壁的厚度随妊娠进展而逐渐变薄，且滋养细胞浸润螺旋动脉壁，而子痫前期孕妇螺旋动脉壁较厚，且螺旋小动脉上几乎不含滋养细胞，大部分滋养细胞距螺旋动脉有相当的距离，这样螺旋动脉的生理重铸不能完成，最终导致胎盘缺氧、灌注不足。妊娠期高血压疾病患者胎盘中MMP－2、MMP－9的低表达使滋养细胞对子宫内膜的侵蚀变表浅，以及螺旋小动脉的侵蚀受阻，导致胎盘浅着床、胎盘缺氧和缺血的特征性病理改变，最终导致子痫前期的发生［9］。

本研究通过免疫组化法检测发现内脂素在正常足月妊娠组胎盘组织中的免疫组化光密度值较高，说明内脂素是母胎界面的一个重要细胞因子，调控着正常妊娠过程。轻度子痫前期患者的胎盘组织中内脂素的免疫组化光密度值较对照组增加(P＜0．05)，重度子痫前期患者的胎盘组织中内脂素的免疫组化光密度值较对照组增加更明显(P＜0．01)，说明子痫前期的发生可能与内脂素表达的异常增加有关。

许多胎盘激素和细胞因子对滋养细胞浸润的调节都是通过控制MMP的分泌而实现的，所以MMP在滋养细胞浸润过程中起重要作用。MMP－2、MMP－9在对照组胎盘组织中表达水平较高，但在子痫前期组MMP－2、MMP－9在胎盘组织中表达水平相对较低。MMP－2、MMP－9的表达水平随子痫前期的严重程度增加而降低。因此推测，某些因素抑制了MMP－2、MMP－9蛋白酶的基因表达，从而使其相对应的滋养细胞的侵袭能力有所降低，从而导致了子痫前期的发病。

子痫前期患者存在明显的脂质代谢紊乱、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化和内皮细胞功能障碍及内皮依赖性血管舒张反应异常。动脉粥样硬化是多种因素共同作用的结果，目前其发病机制尚不清楚，学者多支持损伤－反应学说，认为导致动脉粥样硬化的各种危险因素最终都会损伤动脉内膜，而粥样斑块的形成是对内膜损伤反应的结果。在粥样斑块形成过程中，巨噬细胞具有非常重要的作用。在高血脂症、高血糖等条件下，巨噬细胞能分泌大量氧化代谢产物及生长调节因子，刺激成纤维细胞、平滑肌细胞的迁移和增生，从而形成动脉粥样硬化。目前研究发现巨噬细胞能分泌内脂素，内脂素可通过抑制半胱氨酸蛋白酶Caspase－8和Caspase－3的活性，而抑制各种炎症反应诱导的中性粒细胞凋亡，内脂素水平可能决定心血管系统的炎症状态，从而可能导致动脉粥样硬化的发生［1］。脂肪组织生长期间需要具备补充新生血管的能力，研究表明在体内脂肪组织增长的过程中，内脂素能促进脂肪细胞数量增加及组织形成，此作用是通过对血管产生影响而起作用的［1］。动脉粥样硬化病变区斑块扩大和易破的原因之一是进行性的血管发生，而且血管发生是斑块破裂和血栓形成等并发症的显著危险因素。脂肪细胞因子是血管发生和动脉粥样硬化之间联系的纽带，内脂素在冠心病患者粥样硬化斑块破裂时表达水平增高。由此推测内脂素在以异常新生毛细血管形成为基础的动脉粥样硬化的过程中发挥了一定作用。MMPs是参与动脉粥样硬化的关键酶［8］。而滋养层细胞的自分泌和子宫的旁分泌因子内脂素可调节MMPs的活性，因此母胎界面之间细胞因子的动态平衡对于重建基质和控制侵入是很关键的。

通过对内脂素、MMP－2、MMP－9之间在正常及子痫前期胎盘组织中表达的相关性进行研究，发现内脂素与MMP－2、MMP－9之间呈负相关。说明胎盘组织滋养细胞中内脂素的表达增加可能抑制了MMP－2、MMP－9的表达，内脂素通过调节人脐静脉内皮细胞分泌MMP－2和MMP－9。同时研究发现在胎盘组织中MMP－2与MMP－9之间的表达呈正相关，说明MMP－2和MMP－9共同参与了胎盘滋养细胞的侵袭过程。同时MMP－2与MMP－9是参与动脉粥样硬化斑块发生、发展和破裂的关键酶，故内脂素与MMPs在动脉粥样硬化发生、发展中发挥关键作用。内脂素的异常增加会引起MMPs的反应性减少，从而造成绒毛浅着床和血管痉挛，导致胎盘灌注减少、缺氧，继发胎盘血管内皮损害，血浆成分沉积、脂质蓄积于血管壁出现急性动脉粥样硬化，血管管腔进一步缩窄，胎盘灌注进一步下降，胎盘缺血和代谢障碍使胎盘源性毒性因子的释放增加，损伤血管内皮细胞，引起血管痉挛性收缩，血压升高，导致子痫前期的发病。提示内脂素、MMPs与子痫前期的发病关系密切。

本研究表明内脂素、MMP－2、MMP－9是妊娠期胎盘组织中的重要因子，参与了正常妊娠及子痫前期的发病过程，内脂素、MMPs MMP－2、MMP－9表达水平与子痫前期的严重程度有一定的相关性。联合检测内脂素、MMP－2、MMP－9，对子痫前期的临床诊断、治疗及预后有重要意义。

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