金国贤，孙斌，金硕，曲连军，张瑜

目前对乙型肝炎慢性化的传统治疗方法多采用恩替卡韦等抗病毒药物，通过降解病毒 mRNA直接抑制肝细胞中的病毒复制，并间接刺激免疫系统，但病毒的清除率较低，而其他抗病毒药物虽有效抑制病毒复制但持续时间短，易出现反弹[1]。树突状细胞（dendritic cell，DC）能够刺激机体针对外界病原体的入侵产生足够的免疫反应，我院在传统抗病毒治疗的基础上联合自体 DC 对 HBeAg阳性的慢性乙型肝炎（CHB）进行治疗并与单纯抗病毒治疗效果进行对比，探讨联合自体 DC 治疗效果是否优于单纯抗病毒药物，结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象与材料

1.1.1 研究对象及分组 选择 2010年 8月 –2012年 7月间在我院肝炎门诊确诊的 HBeAg 阳性的 CHB 患者 126 例，17～56 岁，平均 30.2 岁，其中男性 82 例、女性 44 例，CHB 病程 1 ～9年，平均 3.7年，患者持续 HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 阳性，其定量高于 105拷贝⁄ml，ALT >80 IU/L，不合并肝硬化和其他肝炎病毒感染及其严重并发症。126 例患者随机分为治疗组 75 例和对照组 51 例，两组生化指标和 HBV DNA指标相似。治疗组获得本院伦理委员会批准[批准号2010.07 伦审第（32）]和患者签署的知情同意书，采用自体 DC 联合恩替卡韦治疗，对照组仅用恩替卡韦治疗。

1.1.2 实验试剂 RPMI 1640 培养液、rhGM-CSF、rhIL-4、TNF 购自达科为生物科技有限公司；鼠抗人 CD80、CD86、HIA-DR 购自北京利文生物科技有限公司。

1.1.3 实验仪器 倒置显微镜为日本 Olympus公司产品；CO2培养箱为日本三洋公司产品；流式细胞仪和细菌培养仪均为美国 BD 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DC 细胞的获得 无菌条件下抽取患者静脉血 50 ml，肝素抗凝。用蘸有 75% 酒精的纱布擦拭静脉血容器拿至生物安全柜内，盐水 1∶1 稀释抗凝血，缓慢加入淋巴细胞分离液，2000 r/min 离心 20 min，分离单个核细胞吸取细胞层后稀释，用1600 r/min 离心 11 min，去上清计数，重混匀稀释1000 r/min 洗涤 2 次。将（1～2）× 106/ml浓度的细胞移至 75 cm2的培养瓶。于 37 ℃，50 ml/L CO2饱和湿度下培养 3 h，弃上清液加 1640 培养液清洗 2～3 次，去除悬浮细胞，加入有 CSF 和 rhIL-4的培养基，隔日换液，培养至第 6 天加入 HBsAg，4 h 后加入 TNF。继续 37 ℃，50 ml/L CO2饱和湿度下培养 1 d，收获 DC 细胞，用生理盐水冲洗后 1200 r/min 离心 10 min，弃上清用盐水重悬细胞洗涤 2 次后留样，进行细胞计数、细胞活性以及无菌检测以及流式细胞检测。

1.2.2 治疗方法和观察指标 两组均采用口服恩替卡韦 0.5 mg/d，治疗组在此基础上给予 DC 治疗。于皮下注射和静脉输注体内 DC 悬液各 1 ml，连续 3 个月。两组患者于治疗前和治疗后 6 个月检测肝功生化指标和 HBV-DNA 滴度含量，进行比较。

1.3 统计学处理

应用 SPSS19.0 统计软件分析，两组治疗前后及两组间比较采用 t 检验和 χ2检验，P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC 体外培养扩增

外周血单核细胞贴壁 4 h 后获得黏附细胞，加入细胞因子 24 h 后贴壁细胞减少，悬浮细胞逐渐增多，培养时间延长至第 6 天呈积聚现象，并可见到细胞具有树突样突起，台盼蓝染色细胞存活率达 95% 以上，细胞计数平均达到 1×107个/ml。

图1 DC 细胞形态（A：4 h，× 200；B：6 d，× 400；C：7 d，× 400）Figure1 Image of cultured dendritic cells (A: 4 h,×200; B: 6 d,×400; C: 7 d,×400)

图2 CD80+/CD86+ 流式检测对照图Figure2 CD80+/CD86+ flow cytometry control image

图3 CD80+/CD86+ 流式检测图Figure3 CD80+/CD86+ flow cytometry image

图4 CD80+/HLA-DR流式检测对照图Figure4 CD80+/HLA-DR flow cytometry control image

图5 CD80+ /HLA-DR 流式检测图Figure5 CD80+ /HLA-DR flow cytometry image

2.2 HBsAg 致敏 DC 细胞

培养至第 6 天，加入 HBsAg 4 h 后再加入TNF 继续培养 1 d。收获前细胞形态如图 1 所示。

2.3 成熟 DC 细胞的特征标志

收获的 DC 细胞进行流式细胞仪检测 DC 表面 CD80、CD86、HLA-DR 的表达，见图 2～5。

治疗 6 个月后，治疗组和对照组 ALT 和AST 均降到了正常范围，HBeAg/抗-HBe 血清转换率分别为 30.62%（23/75）和 21.4%（11/51）。经 χ2检验 P < 0.05（表 1）。

治疗后 6 个月，治疗组和对照组 HBV-DNA滴度分别为（0.500 ± 0.06）× 103拷贝/ml 和（1.400± 0.12）× 103拷贝/ml，两者差异有统计学意义（表 2）。

表1 治疗前后两组生化指标测定比较（U/L）Table1 Comparison of biochemical parameters after treatment (U/L)

表2 治疗前后两组 HBV-DNA 测定结果的比较（拷贝/ml）Table2 Comparison of HBV-DNA after treatment (copies/ml)

3 讨论

树突状细胞是人类最重要的抗原提呈细胞，促进细胞免疫的功效是其他抗原提呈细胞的数十倍[2]。免疫功能不全，机体对感染的 HBV 处于持续免疫耐受状态是乙型肝炎慢性化的主要原因之一[3]。

HBeAg 阳性慢性乙型肝炎（CHB）具有病程短、炎症活动明显、病毒复制活跃，患者相对年轻等特点[4-5]。以往对 HBeAg 阳性慢性乙型肝炎的治疗多采用 α-干扰素和乙肝病毒复制抑制剂如恩替卡韦、拉米夫定等药物，短时期对病毒有一定的抑制作用，但长期服用易导致抗药性突变体的发生，病毒复制量反弹，宿主的免疫系统未能得到根本的改善和调节，不能产生有效的细胞毒性 T 细胞（CTL）效应[6-7]。

树突状细胞是起源于骨髓的最强的专职抗原递呈细胞，具有启动 T 细胞介导的免疫应答功能，对体内静息 T 细胞激活效率最高[8]。研究表明树突状细胞还具有增强 NK 细胞的功能[9-10]。近年来研究表明，造成慢性肝炎免疫耐受的原因是患者体内树突状细胞抗原递呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信号传递给机体的免疫系统。近几年对树突状细胞的免疫功能的研究有了很大的进展，特别是体外培养慢性乙型肝炎患者的树突状细胞已应用于临床[11]。本项研究在应用恩替卡韦抗病毒药物治疗的同时，联合自体树突状细胞，对 75 例 HBeAg 阳性的慢性乙型肝炎患者进行治疗，并与单纯应用恩替卡韦治疗的对照组进行对照，结果发现治疗组在降低 HBV-DNA 滴度方面明显优于对照组，提示自体 DC 具有抑制患者体内病毒复制，降低血清病毒载量作用，经过体外培养的 DC 可增强慢性乙型肝炎患者免疫功能，达到抑制 HBV 病毒的作用。

HBeAg 血清学转换率是目前诊断慢性 HBV感染者免疫系统控制 HBV 感染能力和接近临床治愈状态的评价指标之一[12]。本项研究治疗组HBeAg 血清学转换率（30.62%）高于对照组（21.4%），提示自体树突状细胞不仅能降低HBV-DNA 载量，改善肝脏功能，也能提高 HBeAg血清学转换率。治疗组和对照组 ALT 和 AST 三个月均降至正常范围，两组无显著差异。

本项研究结果表明恩替卡韦联合自体 DC 可增强慢性乙型肝炎患者的免疫力，并对病毒复制具有明显抑制作用，能够提高 HBeAg 血清转换率。远期疗效有待进一步随访观察。

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