李 建，曹 娟，廖园园，刘 洁，朱 微，秦 伟，秦红刚，漆世华，谢红玲

(武汉中博生物股份有限公司，武汉430070)

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽及野生动物的一种重要的急性传染病，又称“Aujeszky 氏病”［1－2］。随着养猪业的规模化和集约化发展，该病给我国养猪业带来了巨大的经济损失，因此，建立快速有效的诊断检测方法对于控制和消灭PRV具有重要的意义。单克隆抗体技术是20世纪70年代生物学领域的重要成果之一。单克隆抗体具有纯度高、重复性好、且能持续的无限量供应等优点，对疾病的诊断治疗以及疫苗的研究作出了巨大贡献。目前，在兽医临床工作中，PRV的诊断方法多采用病毒分离、PCR技术和ELISA法。但是，这些方法不够完善和深入，高准确度、高灵敏度与快速、简便并存的检测方法目前还不成熟。为了更快速、更准确的诊断疾病，以便对该病采取有效的防治措施，本试验利用PRV全病毒免疫小鼠后建立分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为建立特异性强、敏感性高、简便、快速的抗原捕获ELISA诊断方法提供了条件。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞、实验动物和其他试剂 骨髓瘤细胞、PRV、猪睾丸细胞(ST)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)均为武汉中博生物股份有限公司保存;8周左右的雌性BALB/c购自武汉生物制品研究所。DMEM培养基(Hyclone公司)、次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶(HAT，Sigma公司)、次黄嘌呤胸腺嘧啶(HT，Sigma公司)、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠 IgG(Thermo公司)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗鼠IgG(Thermo公司)、单抗亚类鉴定试剂盒(洛阳赛尔维公司)、生物素标记羊抗小鼠IgG和HRP标记的链霉素(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 病毒增殖与纯化 在ST细胞传代后接种PRV，置37℃ 5%CO2培养箱中进行培养，待75%以上细胞出现病变(CPE)后收毒，收获后的病毒经超滤浓缩，差速离心，蔗糖密度梯度离心［3］，电镜检测。

1.3 免疫 用纯化的PRV与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后，采用皮下多点免疫雌性BALB/c小鼠，分别间隔三周用减半剂量加弗氏不完全佐剂进行二免和三免，融合前3 d腹腔加强注射。

1.4 间接ELISA筛选方法的建立 采用间接ELISA方法，按方阵法［4］确定包被PRV纯化抗原浓度、HRP标记抗体的最适工作浓度。以3，3’，5，5’－四甲基联苯胺(TMB)为底物，测定OD450nm值。以阳性血清OD值在1.0左右，同时与阴性血清OD值差距最大的抗原包被浓度、抗体稀释度为最佳工作浓度。

1.5 杂交瘤细胞株的建立 按常规方法［5］将免疫的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇进行融合，然后置HAT选择性培养基，将其加入到铺有饲养细胞的96孔板中进行培养，间接ELISA和间接免疫荧光方法进行筛选，有限稀释法连续稀释三次，阳性孔单克隆杂交瘤细胞连续传代3个月。

1.6 腹水的生产及其纯化 选12周龄左右的雌性BALB/c，腹腔注射杂交瘤细胞进行腹水的生产，采用辛酸－硫酸铵法纯化腹水。

1.7 单克隆抗体的鉴定

1.7.1 单克隆抗体的效价 采用已经建立的间接ELISA法测定细胞上清和腹水中单克隆抗体的效价。

1.7.2 单克隆抗体的亚类 用间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清中单克隆抗体的亚类。

1.7.3 杂交瘤细胞的染色体分析 按常规方法［6］对杂交瘤细胞的染色体进行分析，于高倍显微镜下观察，每份样本应计数100个中期完整的核细胞，记录染色体数目的分布。

1.7.4 单克隆抗体的特异性鉴定

1.7.4.1 交叉反应 以 PPV、PRRSV、PCV2 为包被抗原，用腹水分别与其进行交叉检测，用间接ELISA检测OD450nm值。

1.7.4.2 间接免疫荧光法(IFA) 用PRV接种于含ST细胞的96孔板中，置37℃ 5%CO2培养箱中培养72 h后用－20℃丙酮固定。按方阵法［7］确定的腹水、FITC标记的抗鼠IgG的工作浓度和反应时间进行IFA检测，于荧光显微镜下观察。

1.7.4.3 免疫组织化学实验(IHC) 组织玻片的制备经取样、固定、包埋、切片、固定。按方阵法［9］确定腹水、生物素标记羊抗小鼠IgG和HRP标记的链霉素最佳工作浓度和反应时间进行IHC检测，经3，3，二甲基联苯胺(DAB)进行底物显色，苏木素复染细胞核之后，于显微镜下进行观察。

1.8 叠加实验 参照文献方法［8－9］进行叠加ELISA实验，并按其公式计算相加指数(AI)。

1.9 相对亲和力的测定 方法参见文献［10］。

1.10 单克隆抗体的稳定性检测 获得的2个细胞株经稳定传代后冻于液氮，1个月后复苏，检测细胞上清抗体。再经腹腔注射BALB/c小鼠，同样检测腹水的抗体效价，并与冻存前效价进行比较。

2 结果

2.1 病毒的增殖与纯化 经密度梯度离心之后总计获得6 mg的PRV病毒，首次免疫剂量为每只100 μg/0.5 mL，电镜结果见图1。

图1 PRV电镜图片(箭头所指为PRV病毒粒子)

2.2 间接ELISA法工作条件的选择 根据方阵法确定间接ELISA方法最佳的PRV包被浓度为0.5 μg/mL。经间接 ELISA 法筛选，3次亚克隆共获得2株分泌抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1E10和5B5。

2.3 腹水的生产及其纯化 每只小鼠腹腔注射1.0×107个细胞，每只小鼠收取5 mL腹水，辛酸－硫酸铵法纯化腹水，SDS－PAGE结果见图2。

图2 PRV单抗SDS-PAGE图

2.4 单克隆抗体的鉴定

2.4.1 单克隆抗体的效价测定 1E10杂交瘤细胞上清的ELISA效价在1∶1000，腹水的ELISA抗体效价在1∶108，腹水的IFA效价1∶2000;5E5杂交瘤上清的ELISA效价在1∶500，腹水的ELISA抗体效价在1∶108，腹水的IFA效价1∶1500。

2.4.2 单克隆抗体的亚类测定 1E10亚类为IgG1，5B5 亚类为 IgG2b。

2.4.3 杂交瘤细胞的染色体分析 杂交瘤细胞的染色体在95～105范围内变化，平均值在98左右，该数值大于脾细胞染色体数的2倍，小于脾细胞与骨髓瘤细胞染色体数目之和，表明该杂交瘤细胞确实为脾细胞与骨髓瘤细胞融合的产物。

2.4.4 单克隆抗体的特异性鉴定

2.4.4.1 交叉反应 间接ELISA检测结果表明:PPV、PRRSV、PCV2均不与PRV腹水发生交叉反应。

2.4.4.2 IFA 试验 腹水 1∶1000稀释，FITC 标记的抗小鼠IgG 1∶100稀释，2株单克隆抗体均能与ST细胞中的PRV发生反应，可见接种了PRV的ST的细胞膜或胞浆中出现了绿色荧光(图3)，阴性对照未见荧光。

图3 PRV单抗免疫荧光图片(400×)

2.4.4.3 IHC 试验 腹水1∶1000稀释，HRP标记羊抗小鼠IgG 1∶100稀释，DAB显色，2株单克隆抗体均能与神经组织中的PRV发生反应，可见感染了PRV的神经组织的胞膜中出现棕黄色着染(图4，400×)，阴性对照组织未见阳性反应。

图4 PRV单抗IHC阳性图片(A)及阴性对照(B)

2.5 叠加实验 2株单抗叠加指数为85.27%，大于50%，说明2株单抗识别不同的抗原位点。

2.6 相对亲和力实验 经非竞争ELISA方法测定1E10的亲和常数为7.4×109L/mol，5B5的亲和常数为6.3 ×109L/mol。

2.7 杂交瘤细胞的稳定性鉴定 2株杂交瘤细胞稳定传代后冻于液氮，1个月后复苏，细胞生长状态良好，抗体分泌水平与冻存前相同。腹腔接种BALB/c小鼠后可致瘤，并稳定地分泌特异性抗体。

3 讨论

本试验采用常规免疫方法制备单抗，虽然耗时较长，但是取得了比较好的免疫效果，制备出来的2株单抗显示出了较好的特异性和稳定性，在这个制备单克隆抗体的试验过程中，抗原质量的好坏决定是否能够顺利筛选出单克隆杂交瘤细胞株，本试验采用了蔗糖密度梯度离心的方法纯化伪狂犬病毒，取得了较好的效果。在筛选的过程中，本试验采用酶联免疫吸附试验、免疫组织化学试验、间接免疫荧光试验三种检测方法共同筛选杂交瘤细胞株，保证了结果的稳定性和可靠性。试验还从杂交瘤细胞的染色体核型、经过连续传代培养和冻存复苏之后的生物学特性、以及单克隆抗体的亚类、纯度、效价、针对的表位等多方面，全方位考察了2株单克隆杂交瘤细胞株分泌抗体的能力强并且稳定。

近年来，国内外有很多 PRV单抗制备的报道［11－13］，但是抗原大多数是原核表达蛋白进行免疫，筛选出来的单抗与天然病毒结合能力弱，没有与其他猪病毒进行交叉反应，只识别同一抗原表位，本研究采用蔗糖密度梯度离心的方法纯化PRV抗原，获得了高纯度的PRV，采用ELISA、IHC、IFA筛选与鉴定，同时与PPV、PRRSV、PCV2进行了交叉反应，结果证明所获得的2株单抗不与 PPV、PRRSV、PCV2发生反应，识别不同的抗原表位，本实验获得的2株PRV单克隆抗体为建立特异性强、敏感性高、简便、快速的PRV诊断方法提供了条件。

［1］ 殷 震，刘景华.动物病毒学［M］.北京:科学出版社，1997:1180－1181.

［2］ 袁庆志，吴裕祥.伪狂犬病流行及疫苗免疫状况［J］.家畜传染病，1986，27(2):65－67.

［3］ 杜念兴.兽医免疫学［M］.第二版.北京:中国农业出版社，1997.

［4］ 焦新安，刘秀梵.实验手册［M］.扬州:江苏农学院传染病教研组，1990:39－50.

［5］ 刘秀梵.单克隆抗体在农业上的应用［M］.合肥:安徽科学技术出版社，1994:32 －36.

［6］ 章谷生，容秉培.单克隆抗体在医学上的应用［M］.上海:上海科学技术出版社，1987.

［7］ 曹雪涛.精编免疫学实验指南［M］.北京:科学出版社，2009.

［8］ 崔尚金，王云峰，王翠兰，等.应用单克隆抗体进行兔轮状病毒的抗原分析［J］.中国兽医科技，1997，27(5):24－25.

［9］ 刘 洁，何文辉，李晶梅，等.分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立［J］.中国兽药杂志，2013，47(7):9－12.

［10］ Macdonald R A，Hosking C S，Jones C L.The measurement of relative antibody affinity by ELISA using thiocyanate elution［J］.J Immuno Meth，1988，106:191.

［11］黄红亮，陈焕春，覃雅丽，等.抗伪狂犬病毒gG蛋白单克隆抗体的制备及鉴定［J］.中国兽医学报，2004，(3):243－245.

［12］ Hampl H，Benporat T，ErlicherL，et al，Characterization of the envelope proteins of pseudorabies virus［J］.J Virol，1984，52:583－590.

［13］ Jacobs L，Meloen R H，Gielkens A L，et al.Epitope analysis of glycoprptein I of pseudorabies virus［J］.J Gen Virol，1990，71:881－887.