严 丽 李 莉 郝 芳 申 伟 张霖雷 郭 浩

(河北医科大学第二医院腺体外科，石家庄 050000)

乳腺癌的发病率已位居女性恶性肿瘤的首位，且呈年轻化的趋势，有关乳腺癌发病机制及治疗方面的实验研究越来越多，而在实验中最为重要的就是乳腺癌动物模型的制备。目前报道多为人乳腺癌细胞的裸鼠异种移植模型，而小鼠乳腺癌细胞移植模型的报道较少。4T1细胞是建立BALB/c小鼠乳腺癌模型较常用的一种细胞株，但在模型制备中所采用的细胞用量往往不统一，用量小造成制模时间延长或制模失败;用量大造成细胞浪费，增加实验成本。本实验采用三种常用剂量、两种不同接种部位进行比较，希望选择一种理想的模型制备方法。

1 材料与方法

1.1 材料 健康BALB/c小鼠90只(购自中国协和医科大学实验动物研究所)，雌性，4～6周龄，体重18～20 g，饲养于河北医科大学实验动物中心SPF级实验室，随机分为3组，每组各30只;4T1乳腺癌细胞株(购自中科院细胞库);胎牛血清;RPMI1640完全培养基;抗小鼠C-erbB-2抗体等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和模型制备 将4T1细胞株进行传代培养扩增，分别制备成 1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1的细胞悬液。分别在3组 BALB/c小鼠胸壁5～6肋间和侧腹壁皮下接种相应浓度的细胞悬液0.1 ml(3组剂量相当于105/只、106/只和107/只)。

1.2.2 模型评定方法 注射4T1细胞后，每天观察小鼠生活饮食及接种部位瘤块的生长情况，包括瘤体出现时间、瘤体大小、成瘤率和8周存活率。第1～8周每隔2 d用游标卡尺测量瘤体的长径(a)和短径(b)，并根据V=ab2/2计算瘤体体积，绘制生长曲线。留取瘤体组织进行HE染色，病理观察。用抗小鼠C-erbB-2单克隆抗体对瘤体组织进行免疫组化染色，镜下观察。

图1 小鼠乳腺浸润性导管癌(HE，×400)Fig.1 Mice breast invasive ductal carcinoma(HE，×400)

图2 乳腺癌组织C-erbB-2阳性表达(×400)Fig.2 Expression of C-erbB-2 in breast tumor tissues( ×400)

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。数据比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤生长情况和病理学检查结果 接种4T1细胞8～17 d时，接种部位出现瘤结节，瘤体增大并与周围组织黏连。14 d后瘤体生长加快，30 d后部分小鼠成瘤部位皮毛破溃。8周后统一处死小鼠，解剖可见瘤体淡黄粉色，具有完整包膜并与周围组织黏连，部分伴有淋巴结转移。瘤体质地中等偏硬，多呈圆形或椭圆形分叶状，组织细胞呈索团状排列，局部可见坏死灶;镜检见癌细胞体积大，胞质嗜酸性，核大，核仁清晰，病理诊断为浸润性导管癌(见图1)。瘤体组织免疫组织化学检测C-erbB-2均呈阳性表达(见图2)。

表1 不同组别成瘤状况比较(n=30)Tab.1 Different groups of tumor status(n=30)

表2 不同接种部位成瘤状况比较(n=45)Tab.2 Different parts of tumor status(n=45)

图3 不同接种浓度下瘤体生长曲线(瘤体体积数值为平方根值)Fig.3 Growth curve of tumor inoculation concentration(Tumor volume number is expressed as square root of itself)

2.2 成瘤时间、成瘤率及荷瘤小鼠存活时间 见表1。

2.3 不同接种部位成瘤时间、成瘤率及存活时间见表2。

2.4 移植瘤的生长曲线 见图3。

3 讨论

随着乳腺癌发病率的逐年升高及年轻化趋势的加强，人们对乳腺癌发病机制及治疗的研究越来越深入，也越来越成为热点。而乳腺癌动物模型的制备，在这一过程中起着非常关键的作用。根据制备方法和研究目的的不同，乳腺癌实验动物模型可分为移植性、诱发性、自发性、基因敲除性及乳腺癌远处转移等5大类。移植性模型是将乳腺癌细胞或组织种植于实验动物胸部或腹部而培养出的模型。此种模型因其生长速度快、成瘤率高、易饲养等优点，已成为临床应用最广的一种模型。诱发性模型是利用物理、化学或生物等因素在实验动物体内诱发肿瘤。该模型多用于病因学及预防性研究，缺点是个体差异大和建模时间长。自发性模型是实验动物种群中自然发生或通过遗传育种培养而形成的一类肿瘤。从肿瘤发生来看与人类肿瘤相似，有利于发病机制的研究;但是，该模型实验时间长，花费大。基因敲除性模型多用于肿瘤发生发展中基因生物学功能的研究。远处转移模型多用于药物开发［1-4］。

目前，乳腺癌动物模型中所选用的动物多为小鼠、裸鼠、大鼠、猫等，其中小鼠和裸鼠因诱癌周期短多被选用。但裸鼠饲养成本较高且免疫功能缺陷不适于临床治疗方面的研究。本实验是针对免疫功能正常的小鼠乳腺癌移植模型的制备，采用的近交系BALB/c小鼠，来源于BALB/c小鼠的乳腺癌细胞株文献报道比较多的是4T1和TM40D两种细胞株。本实验选取4T1细胞株移植于BALB/c小鼠建立乳腺癌模型，这种模型是目前临床药物筛选使用最多的一种乳腺癌模型［5-8］。目前，很多文献报道的4T1细胞用量存在很大的差异，本实验选取了1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1三种常用剂量，同时又分别选取了胸壁5～6肋间和侧腹壁两个常用注射部位进行比较，发现两种不同注射部位种植成活率和肿瘤生长情况之间无差别(P＞0.05)。1×106ml－1、1×107ml－1、1×108ml－1三种常用剂量的种植成活率无统计学意义。但是，1×106ml－1时肿瘤的成瘤时间延迟，种植后16 d左右于接种部位触及直径约2 mm结节，以后迅速增大，于第24天左右直径约10 mm;第30天肿瘤长径约20 mm;其后增长缓慢。1×107ml－1时肿瘤成瘤时间相对早，于种植后10 d左右于接种部位触及直径约2 mm结节，18 d左右直径约10 mm，26 d肿瘤长径约18 mm，其后增长缓慢。1×108ml－1时肿瘤成瘤时间与1×108ml－1时相似，但是肿瘤生长更为迅速。对于临床用药观察来说，1×107ml－1的用量更为经济合理，更易于用药周期的安排，是最理想的模型制作方法。

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