李霞斌，刘 俊，蒋 堃

乳腺癌是世界妇女发病率占第一位的恶性肿瘤，近年我国乳腺癌发病率持续上升，每年增长3～4个百分点，并呈明显的年轻化趋势［1］。国内外专家建议对所有原发和复发乳腺癌标本进行ER 和PR表达水平检测，作为选择临床治疗方案和辅助内分泌治疗的依据。ER 和PR 作为乳腺癌内分泌治疗疗效的重要预测标记，其检测结果的准确性是临床选择治疗方案的重要依据［2-3］。Ki-67 反映肿瘤细胞的增殖活性而与乳腺癌辅助治疗反应有关［4］。ER、PR及Ki-67的检测在乳腺癌个体化内分泌治疗中的应用已成为临床不可或缺的依据。

免疫组织化学法因操作简便、重复性好、成本低廉等优势，是目前临床上广泛应用的检测技术。但据最新资料统计，目前ER、PR 免疫组织化学检测结果的假阳性和假阴性率高达20%［4］。在临床和回顾性研究工作中我们常遇到一些会诊和时隔几年后进行乳腺癌免疫组化检测的病例。对于陈旧性乳腺癌石蜡标本，按照新鲜蜡块修复方法检测结果常不理想，有些抗原常检测不出，或仅呈弱阳性，特别是核抗原。为了给临床和科研提供真实可靠的信息，我们对陈旧性乳腺癌标本主要核抗原ER、PR、Ki-67 的修复方法进行探索。

1 材料与方法

1.1 检测组织 随机选取泸州医学院附属医院病理科2010 年1 月～2011 年12 月浸润性乳腺癌石蜡标本120例。

1.2 试剂 兔抗人ER、PR单克隆抗体（克隆号：SP1、SP2，福建迈新），鼠抗人Ki-67 单克隆抗体（克隆号：MIB-1）、即用型Envision检测试剂盒、DAB显色试剂盒、EDTA（pH9.0）抗原修复液均购于丹麦DAKO公司。

1.3 实验方法 石蜡标本3μm 连续切片，60℃烤箱烤片4h，二甲苯脱蜡后梯度酒精至水。切片置于EDTA（pH9.0）抗原修复液中：（1）高压修复：高压锅加蒸馏水加热至沸腾，将切片放入盛修复液的修复盒内盖上加压阀，继续加热至喷气，分别维持喷气时间5、10、15、20min后立刻离开热源，自然冷却至室温。（2）水浴修复：切片放入盛有修复液的修复盒，之后放入沸水浴锅内，修复30min 后离开热源，自然冷却至室温。3%甲醇双氧水封闭过氧化物酶10min。一抗室温孵育3h，二抗室温孵育30min，DAB显色、苏木素复染。脱水、透明，中性树胶封片。

1.4 结果分析 ER、PR 和Ki-67 阳性物质均定位于肿瘤细胞核，每张切片随机选取10个高倍视野（40×）计数阳性细胞数，采用阳性表达率半定量分级标准：（1）ER/PR 阳性定义为：＜1%为（-），1%～33%为（1+），34%～66%为（2+），＞66%为（3+）；（2）Ki-67 肿瘤细胞阳性率＜10%为（-），10%～50%为（1+），51%～75%为（2+），＞75%为（3+）。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件对数据进行分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同修复时间对ER、PR 和Ki-67 染色抗原表达的影响 切片经15、20min 高压修复和水浴30min修复后，ER、PR的阳性表达较理想，细胞核阳性着色强且背景干净，细胞质和间质中无非特异性着色；着色时间在20min 组最短，15min 高压修复和30min 水浴修复组着色时间部分切片稍有延长、染色强度稍有减弱；修复5、10 min 组ER、PR 部分切片仅组织边缘有阳性细胞，阳性着色深浅不一，染色时间也稍长。Ki-67 抗原的表达在15、20min 修复条件下表达较理想，染色均匀无背景染色；在高压修复5、10 min 和水浴30min 的情况下染色均不理想，着色不均匀更明显，部分肿瘤细胞染色呈浅黄色，模糊难以判断。对于修复时间＞10min的切片，部分切片的脂肪成分有轻微掉片现象，但肿瘤组织保存较好，不影响结果判读。

2.2 不同抗原修复时间对癌细胞ER、PR 和Ki-67 阳性率的影响 随修复时间的延长总阳性率由高到低依次是：20min、15min、水浴30min、10min、5min，且20min 组高级别阳性率最高。ER、PR 在修复时间＞15min阳性率明显提高。Ki-67在高压修复15、20min阳性率较水浴30min 及高压修复5min、10min 明显提高。ER、PR、Ki-67在20min组阳性信号强，阳性率最高，与5、10min 组差异有显著性（P＜0.05），与其余各组比较差异无显著性（P＞0.05），但高压20min和水浴30min 比较Ki-67 的表达较ER、PR 的表达差异更明显。经不同时间修复各指标在乳腺癌的阳性表达，见表1。

表1 ER、PR、Ki-67在不同修复时间下的表达（n=120）

3 讨论

组织在固定过程中，经甲醛、加热、有机溶剂等处理使蛋白质发生交联、变性，其抗原决定簇被封闭而无法表达。抗原决定簇的充分暴露是决定免疫组织化学结果的关键［5］。有研究发现与空气接触的切片在室温下保存3个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱或阴性；抗原对多数抗体的敏感性下降50%，部分切片保存6个月多数抗体做不出阳性结果，尤其核表达抗原丢失更为突出，其原因可能与氧化作用有关［6］。对于陈旧性石蜡组织，在保存过程中虽然表面有封蜡，但不是完全的真空状态，氧化作用不可避免，可能会导致部分抗原的丢失，特别是浅表组织；同时存放时间越长其抗原决定簇被封闭时间也越长，要将其暴露也越不容易，特别是核抗原的暴露，也许这就是大部分陈旧性蜡块抗原表达差的原因之一。

目前认为影响核抗原暴露的主要因素有抗原修复液的pH 值、修复温度、压力、持续时间［7］。日常免疫组化工作中对于核抗原，大家逐渐选用高pH 值修复液进行高压修复［8］。只有达到一定的温度和时间，抗原暴露充分，染色效果才好。在本实验中我们均采用pH9.0 的EDTA 修复液，比较不同高压修复时间之间以及高压修复与水浴修复间的差异，发现随着高压修复时间的延长，抗原表达逐渐增强，20min 的高压修复是陈旧性乳腺癌蜡块主要核抗原表达的最佳修复条件；而水浴修复的时间虽长，但其效果和短时间的高压修复差不多，对于Ki-67 抗原的表达尤其明显。究其原因可能是修复时间的延长能使抗原决定簇暴露更加充分，有利于抗原、抗体更好结合；热修复时间延长还能洗脱部分大分子抗原，降低背景着色［9］。另一方面高压加热的温度可达到120℃，而水浴修复在有一定海拔高度的地方很难达到100℃，组织在120℃的高温下维持蛋白质三级结构的氨基酸侧链基团的次级链断裂，产生更多有功能的特征性蛋白质三级结构，暴露了更多的抗原结合点［10］。对于长时间高温高压修复可能出现的脱片、非特异性背景染色等不良后果，随着载玻片防脱技术的不断改进，只有小部分组织有脱片现象，而且随着抗体和免疫组化检测系统的不断优化，背景染色也鲜有出现。

不同的抗体其最佳修复条件存在差异，但是通过摸索可寻求它们的共同最佳修复条件，在实际工作中节省时间。对于陈旧性乳腺癌石蜡标本，我们在日常免疫组化工作中应该区别对待，尽可能的为临床提供真实可靠的信息；在科研工作中，也应本着求真务实的精神，不断探索最佳实验条件，提供详实的数据。通过本实验，对于存放时间稍长的乳腺癌石蜡包埋组织，我们认为应采用EDTA（pH9.0）高压修复20min，让抗原如实表达。

［1］韩艳清，李卓，李文红，等.乳腺癌发病趋向及X射线摄影普查的研究［J］.中国医学装备，2013，10（12）：11-13.

［2］Hammond M E H，Hayes D F，Dowsett M，et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer［J］.J Clin Oncol，2010，6（4）：195-197.

［3］代莹，傅静，魏兵，等.经他莫昔芬治疗的乳腺癌ER、PR 阳性率和染色强度与预后的关系［J］.临床与实验病理学杂志，2013，29（4）：419-423.

［4］陈守菊，刘福川.乳腺癌ER、PR、PS2、C-erbB2，Ki-67 联合检测的临床意义［J］.临床和实验医学杂志，2011，10（9）：653-654.

［5］Shi S R，Shi Y，Taylor C R.Antigen retrieval immunohistochemistry review and future prospects in research and diagnosis over two decades［J］.J Histochem Cytochem，2011，59（1）：13-32.

［6］王丽，张秋金，林齐心.初论免疫组化标准化（一）［J］.诊断病理学杂志，2005，10（5）：310-311.

［7］蒋洁，罗志飞，蓝永洪，等.免疫组化染色中核抗原暴露的优化［J］.海南医学院学报，2013，19（6）：728-730.

［8］林齐心，陈赞烽，熊玉林.抗原修复条件的变化对Ki-67 免疫组化染色的影响［J］.诊断病理学杂志，2012，19（6）：37.

［9］杜娟，石雪迎，郑杰，等.抗原修复液pH 值及修复时间对免疫组化染色效果的影响［J］.北京大学学报（医学版），2005，37（2）：195-197.

［10］沈溪明，何欣欣，吴东霞，等.甲状腺转录因子TTF21抗原修复方法的探讨［J］.诊断病理学杂志，2007，14（2）：153.