熊海军，张兴坦，吴向伟，谢小东，聂梦云，王根洪，夏庆友

家蚕基因组生物学国家重点实验室，西南大学，重庆市北碚区天生路2号 400715

栽培烟草抗逆相关WRKY转录因子的表达特征分析

熊海军，张兴坦，吴向伟，谢小东，聂梦云，王根洪，夏庆友

家蚕基因组生物学国家重点实验室，西南大学，重庆市北碚区天生路2号 400715

采用RT-PCR反应从栽培烟草中克隆获得三条全长WRKY家族保守序列，长度分别为677bp、672bp、629bp,定名为NtWRKY10、NtWRKY11、NtWRKY12。生物信息分析表明三个基因与已经报道的拟南芥WRKY家族基因具有较高同源性，保守结构域属于第二类WRKY转录因子。RT-PCR分析表明，SA、ABA、MeJA 等信号分子均能诱导这三个基因的上调或下调表达，表明这三个基因可能在栽培烟草抗逆反应中起作用。

烟草；WRKY转录因子；克隆；信号分子

转录因子是能够结合在基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，表现出激活或抑制靶基因转录的功能。其中WRKY转录因子是一类植物中所特有的转录因子。这类转录因子最先由Ishiguro等从甘薯中分离[1]。目前在至少20多种植物中发现了WRKY转录因子，并阐明了相应的生物学功能[2]。

WRKY转录因子至少含有一个高度保守的WRKY结构域，该结构域由大约60个氨基酸残基组成的。在N末端有7个绝对保守的氨基酸残基WRKYGQK，是WRKY结构域的核心序列[3]。WRKY转录因子被分为三类[4]，第一类含有两个典型WRKY结构和Cys2.His2锌指结构；第二类含有一个典型WRKY结构域和Cys2.His2锌指结构；第三类含有一个WRKY结构域和Cys2.His／Cys的锌指结构。WRKY结构域具有DNA结合能力，是WRKY蛋白生物学活性必需的，若WRKY结构域中的氨基酸发生了变异，往往会导致其失去或减弱DNA结合活性[5]。

WRKY转录因子与生物或非生物胁迫应答、植物生长发育以及衰老有着密切的关系。大量研究工作证实大多数WRKY蛋白主要参与了植物从基础免疫到获得性抗性的多种抗病反应之中，通过调控多通路多层次的抗病信号转导途径影响植物对病原物的生理反应，在植物与病毒、细菌、真菌、线虫以及昆虫的相互作用过程中发挥重要作用[6-7]。植物在干旱、高温、低温和损伤等非生物胁迫应激下会诱导WRKY基因快速表达[7]。例如拟南芥中的AtWRKY25、AtWRKY28、AtWRKY40和AtWRKY70同时受到高盐、高温、渗透胁迫的诱导[8]。其次，WRKY转录因子还参与植物的生长发育与新陈代谢。野燕麦中发现两个WRKY蛋白ABF1和ABF2可以结合淀粉酶基因α-Amyl基因启动子区的W盒上进而调控a-Amyl基因的表达[9]。另一方面，利用WRKY转录因子提高植物抗逆性的研究已取得了一定进展，如超表达AtWRKY33提高了拟南芥对灰霉病和黑斑病两种真菌性病害以及盐胁迫的抵抗能力[10-11]；OsWRKYl3的超表达增强了水稻对纹枯病和稻瘟病的抗性[12]；VvWRKYl在烟草中的表达增强了植株对腐霉病、霜霉病和白粉病三种真菌性病害的抗性[13]。综上所述，WRKY转录因子对植物有着非常重要的作用。

烟草作为一种茄科植物，既是一种重要的模式植物，也具有重要的经济价值。在烟叶生产中经常受到高盐、低温、病原菌的影响，其遗传改良越来越受到重视。本实验以烟草为材料，利用RT-PCR技术克隆获得了WRKY10、WRKY11、WRKY12基因，并探究其与其他物种WRKY蛋白的系统发育关系以及在SA、ABA、JA三种胁迫条件下的表达情况。为进一步研究WRKY转录因子基因功能，进而通过分子育种获得高抗逆材料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2.1 供试植物材料

将红花大金元烟草种子播种于MS固体培养基上，培养条件为光照16h，28℃，黑暗8h，25℃。待幼苗长至5-6真叶期，洗去培养基，并将幼苗浸在灭菌水中培养1周，使其适应环境。再用各种激素（激素处理分别为：ABA 200µM，SA 2mM，MeJA 100µM）处理幼苗，在0h，1h，2h，5h，10h，24h时间点取样，每个时间点取样至少三株。

1.2.2 试剂

Roche公 司 Tripure Isolation Reagent；Promega公司反转录系统，RNase-Free DNase和Go Taq Green DNA聚合酶；Biowest公司琼脂糖； Transgen公司pEASY-T1克隆载体和TransT1大肠杆菌感受态；百泰克公司DNA回收试剂盒。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

将1 ml Trizol加入EP管（样品大于10%Trizol体积量），加入冰冻样品匀浆，4℃12000rpm高速离心10 min，取上清静置5 min，使核苷酸链打开，加入200 μL（1 mL体系）氯仿，剧烈摇晃15 s，20℃静止10 min，然后4℃ 12000 rpm高速离心15 min，取上清加入500 μL（1 mL体系）异丙醇翻转摇晃几次，20℃静止5 min使RNA形成，4℃ 12000 rpm高速离心10 min去除上清液，加入75%己醇漩涡清洗RNA，4℃ 7500 rpm离心5 min,去上清风干5 min,加入无RNase水50 ml吹打几次，55℃孵育15 min,最后将产物用RNase-Free DNase消化（具体步骤按产品说明书流程操作）。

在上述10 μL的体系RNA中加入Oligo（dT）1.5 μL，DEPC 水上调体系至 15 μL，混匀后 70℃反应 10 min，冰浴 2 min；再加上 5×buffer 5.0 μL，dNTP（2.5mmol/L）4.0 μL，PNase inhibitor 1.0 μL，M-MLV逆转录酶 1.0 μL，42℃温浴65 min，70℃保温5 min，即得cDNA。

1.3 PCR扩增和基因的克隆

以cDNA为模板，采用15 μL体系进行扩增：cDNA 1 μL,ddH2O 4.5 μL,sense primer 1 μL，Anti-Sense prime 1 μL，Taq聚合酶7.5μL。扩增程序为：94℃预热3min，按94℃变性30s。1%的琼脂糖电泳分离PCR产物中的目的条带。片段回收按照百泰克DNA回收盒进行，PCR产物载体连接按照Transgen公司的说明书进行，PCR产物5 μL，pEASY-T1载体1 μL，37℃连接15 min，连接产物转化大肠杆菌TransT1进行蓝白斑筛选。使用Primer Premier 5分别设计全长引物和检测引物。

1.4 多序列比对与系统发育树的构建

从NCBI中下载相关WRKY序列，使用Multalin在线软件对推测的氨基酸序列进行比对。利用Mega5.0软件通过氨基酸序列比对将其他物种WRKY家族成员与目的序列构建了N-J（Neighbor-Joining）系统发育树。

1.5 NtWRKY10，NtWRKY11和NtWRKY12三个基因的半定量分析

根据目的基因序列设计半定量引物（表1）扩增目的基因。经克隆测序验证其特异性后，依次采用各种激素处理的cDNA模板分析该基因表达差异。同时根据GenBank中EF-1a基因保守序列设计引物EF-1aF和EF-1aR（表1）作为内参基因以确定PCR的模板量。为了证实外源信号处理实验的有效性和准确性，我们采用NtPR1a，NtSAM1和NtODC基因分别作为ABA，SA和MeJA诱导表达的marker基因[14-16](表1）。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行分析。

表1 本研究中设计的引物及其序列Tab.1 Primers involved in this article

2 结果与分析

2.1 NtWRKY10-12三个基因全长ORF的克隆

以烟草各种激素处理的混合cDNA为模板，基于经生物信息分析获得的基因序列，设计烟草WRKY两端特异性引物进行PCR扩增，得到约600bp的特异条带（图1），经回收连接到pEASY-T1载体挑取阳性克隆后送于华大基因测序，得到NtWRKY10、NtWRKY11、NtWRKY12三个基因全长ORF分别为677 bp，672 bp，620bp。经过NCBI的ORF-finder翻译，发现三个基因全长ORF分别编码178、175、208个预测氨基酸的蛋白质。

2.2 NtWRKY10-12氨基酸多序列比对和系统发育树的构建

为进一步明确NtWRKY10-12三个基因预测蛋白质序列的特征，从NCBI下载相关WRKY蛋白序列，使用Multalin在线软件对其推测的氨基酸序列进行同源性比对（图2）。

图1 烟草NtWRKY10-12三个基因的PCR分析Fig.1 Electrophoresis analysis of WRKY10 WRKY11 WRKY12 PCR product

图2 烟草NtWRKY10-12三个基因预测蛋白质序列与其它WRKY转录因子氨基酸序列比较Fig.2 Multi-alignment of NtWRKY10-12 and other WRKY proteins

氨基酸序列比较得出：N末端含有WRKY蛋白的标志片段WRKYGKK，以及C末端为锌指结构CX4CX23HXH。WRKY分为三类，其中第二类含有一个WRKY保守域和结构为CX4-5CX22-23HXH的锌指结构[14-15]。比较发现NtWRKY10-12与第二类WRKY转录因子相符，可以认为这三个基因应属第二类转录因子。另外，WRKY转录因子除含有高度保守的结构域外，其他位置片段可变度较高，故而其功能也应具多样性。

为了解 NtWRKY10、NtWRKY11 、NtWRKY12与其他WRKY家族成员的关系，利用Mega5.0软件将上述三个转录因子与其他物种WRKY家族成员的氨基酸序列构建了N-J（Neighbor-Joining）系统发育树（图3）。

图3 NtWRKY10-12三个基因编码的蛋白与其他WRKY家族成员构建的N-J系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of NtWRKY10-12 and other plant WRKY protein

系统发育分析显示NtWRKY10和NtWRKY11氨基酸序列与AtWRKY50具有较高的同源性，这暗示着它们可能具有相似的功能。NtWRKY12与AtWRKY51同源性较高，暗示他们可能是直系同源基因，并且行使相似的功能。

2.3 不同胁迫条件下栽培烟草红花大金元NtWRKY10、NtWRKY11、NtWRKY12三个基因的表达分析

为了探索三个WRKY基因在不同胁迫下的表达情况，我们采用脱落酸(abscisic acid，ABA)、水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸甲酯（jasmonic acid，MeJA）三种外源信号分子进行诱导表达实验分析 (图4)。

结果显示，NtWRKY10和NtWRKY11在ABA处理1 h和2h时表达量上升，而NtWRKY12受ABA诱导的结果却不明显（图 4A）。

SA对三个基因的诱导表达情况都较为明显（图4B），NtWRKY10和NtWRKY11在经过SA处理2 h和24 h时，表达水平明显上调。NtWRKY12则在SA处理10 h时表达量最高。SA是植物抗病反应重要的信号分子，三个WRKY基因受SA诱导上调表达的事实暗示着它们在参与植物的病原诱导的防御反应中扮演着重要的角色。

烟草三个WRKY基因受茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制表达，处理2小时后表达水平明显下调。处理24小时后抑制效果逐渐消除（图 4C）。

图4 NtWRKY10-12在ABA（图 4A）、SA（图 4B）、MeJA（图 4C）三种外源信号分子诱导表达情况Fig.4 NtWRKY10-12 gene expression effect by ABA (Fig 4A),SA (Fig 4B),MeJA (Fig 4C)

3 结论与讨论

WRKY转录因子作为一种重要的诱导型调节因子，参与植物的多种反应、生长发育调节及物质代谢调节等多种重要生理活动。本研究结果发现三个WRKY转录因子均只含有一个高度保守的WRKY结构域，属于WRKY超家族中的第二亚族。根据系统进化树分析比较，这三个基因与大豆GmWRKY6、GmWRKY21以及拟南芥AtWRKY51的同源性较高，其中GmWRKY21被报道直接参与低温胁迫反应[16]，故而与其同源性较高的NtWRKY12也可能执行类似的功能，然而AtWRKY51和GmWRKY6的功能未见详细的报道。由于WRKY超级基因家族中除WRKY保守域高度保守，其余区段可变性很高，表明WRKY转录因子功能位点在保守区域。根据文献报道，SA、MeJA 等外源诱导物能被植物细胞膜的某些受体特异识别并结合，继而激活促分裂原激活蛋白激酶信号网络通路，促分裂原激活蛋白激酶可以通过磷酸化或者去磷酸化将细胞外的信号放大并传导进入细胞核内，从而激活或抑制WRKY 类转录因子的活性[17]。从实验结果来看，NtWRKY10等三个基因表达水平随着诱导物处理时间变化而变化，在信号分子诱导下其表达特征不尽相同。

本研究证实ABA、SA和MeJA可诱导三个转录因子的上调或下调表达，表明它们可能在植物参与生长、发育以及抗逆过程中能实现功能互补与协调，因此可将这个性质加以利用，以提高植物对非生物胁迫的适应性。

本研究将在后续工作中，构建重组表达干扰载体并将目标基因转入烟草，筛选烟草重组植株，进行表型分析，进一步研究相关基因的功能。

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Expression analysis of WRKY transcription factors related to stress response in cultivated tobacco

XIONG Haijun,ZHANG Xingtan,WU Xiangwei,XIE Xiaodong,NIE Mengyun,WANG Genhong,XIA Qingyou
State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology,College of Biotechnology,Southwest University,Chongqing 400715,China

Three full-length WRKY-domain cDNA sequence of 677bp,672bp and 629bp,named NtWRKY10,NtWRKY11 and NtWRKY12 were cloned by RT-PCR from cultivated tobacco induced by SA,ABA and ET.Bioinformatics analysis showed that the three genes were highly similar with the reported WRKY family genes in Arabidopsis thaliana,which belonged to the second WRKY transcription.Results showed that molecules signals such as ABA,SA,MeJA could induce up-regulated expression or dowm-regulated expression,which indicated that the three genes play a role in stress response in cultivated tobacco.

tobacco; WRKY transcription factors; cloning; signal molecules

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.06.023

S572.01; Q 7 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）06-0144-06

中国烟草总公司烟草基因组计划重大专项（110201301011A（JY-11A））；中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2013C043)；西南大学博士基金(SWU112061)；云南省烟草公司科技计划项目(2013YN08)

熊海军（1990—），硕士，研究方向：生物化学与分子生物学，Email:songxiaoming@ swu.edu.cn

王根洪（1980—），博士，副研究员，Email: wanggh168@swu.edu.cn

2014-04-21