冷晓红，李小萍，张 彤

(1.宁夏职业技术学院，银川750021;2.宁夏泰瑞制药股份有限公司，宁夏永宁750101)

磷酸替米考星可溶性粉为替米考星磷酸化后制成的可溶性粉制剂，为国家三类新兽药，临床试验研究表明:治疗鸡支原体肺炎、慢性呼吸道疾病［1-2］和猪的支原体肺炎效果显著，且具有较好的安全性［3-5］。磷酸替米考星可溶性粉制剂克服了替米考星不溶于水，生物利用度低，不方便临床用药等问题，是安全有效治疗家畜呼吸系统疾病的新兽药，但目前尚未有磷酸替米考星可溶性粉含量测定方法的报道，本试验通过建立高效液相色谱法测定磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量的方法，为磷酸替米考星可溶性粉的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(二极管阵列检测器，日本岛津);WondaSil C18-WR色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)(日本岛津)。

1.2 试剂与样品 替米考星对照品，批号:K0310711，含量91.0%，中国兽医药品监察所提供;磷酸替米考星可溶性粉，批号:20100518、20100519、20100520，宁夏泰瑞制药股份有限公司研制;乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其它均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验 参考相关文献［6-7］，选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以水-乙腈-磷酸二丁胺缓冲液〔取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液(1→10)70 mL，边加边搅拌，放置冷却后，用磷酸调节pH值至2.5±0.1，加水至100 mL〕-四氢呋喃(805∶115∶25∶55)为流动相;流速为每分钟1.0 mL;检测波长为280 nm，系统适应性试验结果表明，替米考星的顺式和反式异构体峰峰面积之和的相对标准偏差为0.70%，，理论板数按替米考星顺式峰计算不低于3000，替米考星的顺式和反式异构体峰之间的分离度应符合要求。替米考星反式异构体峰的相对保留时间为0.9，替米考星顺式异构体峰的相对保留时间为1.0(图1-图2)。

图1 替米考星对照品HPLC色谱

图2 磷酸替米考星可溶性粉HPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取替米考星对照品25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加乙腈10 mL超声溶解，用流动相稀释至刻度，混匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取磷酸替米考星可溶性粉适量(相当于替米考星25 mg)，精密称定，置50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 测定法 按2.1项色谱条件，分别精密量取对照品和供试品各10 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图，外标法以顺式和反式异构体峰面积之和计算磷酸替米考星含量。

2.3 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂及按工艺处方制备的不含主药的阴性溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，按照上述方法测定。结果阴性溶液及空白溶剂对试验无干扰。

2.4 线性关系考察 取替米考星对照品250 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加乙腈10 mL超声溶解，用流动相稀释至刻度，混匀。取上述溶液0.1、0.2、0.6、1.0、1.5、2.0 mL 分别置于10 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度。取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱峰至主峰保留时间的2倍。以顺式和反式异构体峰面积之和为纵坐标，以浓度为横坐标，计算线性，结果表明:替米考星在0.0516～1.032 mg/mL范围内，线性关系良好。回归方程及为:

2.5 精密度试验

2.5.1 重复性试验 取同一批号磷酸替米考星可溶性粉供试品(批号20100518)6份，按照上述测定方法测定，结果替米考星顺式和反式异构体峰面积之和的RSD为0.4%，表明重复性良好。

2.5.2 中间精密度试验 取同一批号供试品(批号20100518)6份，分别由A、B、C三人，在不同的时间，用不同仪器(Waters 515高效液相色谱仪、兰博SSI LabAlliance高效液相色谱仪、日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪)，按照上述含量测定方法测定，结果精密度良好，RSD为0.27%。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，自制备后，按含量测定方法，分别在 0、1、3、6、12 h 进样测定。结果替米考星顺式和反式异构体峰面积之和的RSD为0.12%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 加样回收率试验 取已知含量的磷酸替米考星可溶性粉，批号:20100518，含量以替米考星(C46H80N2O13)计 为 9.69% 约 100.0、130.0、150.0 mg各三份，精密称定，分别置于50 mL量瓶中，分别加入替米考星对照品溶液(5.3040 mg/mL)2、2.5、3 mL各三份，用流动相稀释至刻度，混匀。取上述溶液各10 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图。按外标法以顺式和反式异构体峰面积之和计算磷酸替米考星回收率，结果见表1，平均回收率为98.5%，RSD为2.0%。

表1 磷酸替米考星可溶性粉回收率试验结果

上述方法学验证的试验结果表明，按照“2.1”项下的色谱条件进行磷酸替米考星可溶性粉的含量测定，方法可行。

2.8 样品测定 取磷酸替米考星可溶性粉供试品3 批(批号:20100518、20100519、20100520)，按上述含量测定方法操作，测定其含量，三批产品的标示含量分别为96.9%，92.6%和93.2%。

3 讨论与小结

紫外吸收图谱显示:替米考星在280 nm～290 nm之间均有最大吸收波长，参考相关文献［4-5］，选择280 nm为测定波长。

在试验中比较了水-乙腈-四氢呋喃-磷酸丁胺缓冲液(805∶110∶60∶25)［8］;将乙腈 105 mL、四氢呋喃53 mL、磷酸二丁胺缓冲液30 mL加入700 mL水中，用水稀释到1000 mL［9］;乙腈-四氢呋喃-1 mol/L二丁胺磷酸盐缓冲液(130∶55∶25)［10］及水-乙腈-磷酸二丁胺缓冲液-四氢呋喃(805∶115∶25∶55)为不同流动相体系，结果确定了本方法的流动体系，磷酸替米考星中替米考星顺式和反式异构体峰之间及与其他成分可以得到较好的分离。

目前关于替米考星含量测定的文献报道很多，但替米考星磷酸成盐后，进一步制成可溶性粉制剂，用HPLC法测定磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量的方法未见报道。

本研究所建立的方法专属性强、简便、准确，可用于磷酸替米考星可溶性粉的质量控制，同时为磷酸替米考星可溶性粉质量标准的建立提供了依据。

［1］宗昕如，张晓辉，辛凌翔，等.磷酸替米考星可溶性粉对人工感染鸡支原体的治疗试验.畜牧与兽医［J］，2013，8:88-92.

［2］张继瑜，李艳春.磷酸替米考星饮水剂治疗鸡败血支原体的疗效试验，中国畜牧兽医［J］，2004，31(12):39-40.

［3］张晓辉，宗昕茹，辛凌翔，等.磷酸替米考星对人工感染猪支原体肺炎的治疗试验.中国兽医科学［J］，3013，43(5):515-521.

［4］中国兽药杂志编辑部.磷酸替米考星.中国兽药杂志［J］，2003，37(8):4.

［5］宗昕如，张晓辉，辛凌翔，等.磷酸替米考星可溶性粉在靶动物鸡的安全性试验.畜牧与兽医［J］，2014，2:27-32.

［6］宋艳红，孙 浩，等.HPLC法测定复方替米考星颗粒中有效成份含量.中国兽药杂志［J］，2010，44(8):27-30.

［7］中国兽药典委员会.中国兽药典，二○一○年版一部.［S］.

［8］张旭东，吕瑞娥.高效液相色谱法测定饲料中替米考星含量.中国饲料［J］，2010，9:27-30

［9］闫春芝，赵红彦，秦朝英.高效液相色谱法测定替米考星含量.中国兽药杂志［J］，2006，40(8):26-27.

［10］张宝国.替米考星的高效液相分析，郑州大学学报(理学版)［J］，2003:35(3):70-72