嵇海澄??王倜??王春玲??李孝壁

[摘要] 目的 参考USP、EP，探讨并建立酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素标准与检查方法（凝胶法）。 方法 按《中国药典》（2010年版）二部附录ⅪE细菌内毒素检查方法进行。 结果 经验证，酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素限值确定为L<2.0IU/mg（以长春瑞滨计），通过稀释法可消除干扰，无干扰浓度为0.035mg/mL（以长春瑞滨计）。 结论 可按此标准采用本法对本品进行细菌内毒素检查。

[关键词] 酒石酸长春瑞滨；细菌内毒素检查方法验证；凝胶法

[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）21-105-03

酒石酸长春瑞滨（vinorelbine tartrate）化学名3，4-二去氢-4-去氧-8-去甲长春碱二酒石酸盐，属于长春碱类抑制细胞分裂的抗肿瘤药物，主要通过抑制微管蛋白的聚合，使细胞分裂停止于有丝分裂中期[1]，是一细胞周期特异性的药物。临床上主要与其他抗癌药物联合应用于治疗非小细胞肺癌，也可用于晚期乳腺癌[2-5]、食管癌等。FDA于1994年批准酒石酸长春瑞滨用于晚期非小细胞肺癌患者的一线治疗。无菌检查、细菌内毒素检查、微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目[6]。

本品制剂为酒石酸长春瑞滨注射液，其国内现行标准为《中国药典》，明确规定了细菌内毒素检查的项目与标准[7]。酒石酸长春瑞滨目前国内现行标准为《中国药典》，现标准中未规定细菌内毒素的控制项目与标准[7]。为更好地控制制剂的细菌内毒素水平，对酒石酸长春瑞滨原料开展建立细菌内毒素检查标准与方法的研究，参照《中国药典》（2010年版）二部附录ⅪX M化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则及附录ⅪE细菌内毒素检查法[7]、USP（85）BACTERIAL ENDOTOXIN TEST[8]、EP（2.1.6.4）BACTERIAL ENDOTOXIN TEST[9]以及EP8.0中酒石酸长春瑞滨细菌内毒素标准[10]、USP37-NF32中酒石酸长春瑞滨注射液的细菌内毒素标准[11]，建立并验证本品种的细菌内毒素检查标准与方法。

1 实验材料

1.1 仪器

电子分析天平、DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱、XW-80A旋涡混合器、DK-600电热恒温水槽、HH-2F净化工作台。

1.2 试剂

1.2.1 细菌内毒素工作标准品 规格160EU/支，批号150601-201174，中国药品生物制品检定所。

1.2.2 鲎试剂 鲎试剂1（λ=0.03EU/mL，规格0.1mL/支，批号1211022，湛江安度斯生物有限公司）；鲎试剂2（λ=0.03EU/mL，规格0.1mL/支，批号12060612，福州新北生化工业有限公司）。

1.2.3 细菌内毒素检查用水WBET 规格50mL/瓶，批号13020315，褔州新北生化工业有限公司。

1.2.4 碱性pH调节剂 规格2mL/支，批号121127，褔州新北生化工业有限公司。

1.2.5 酒石酸长春瑞滨 批号：130701、130702、130901。

2 方法（凝胶法）

2.1 试验准备

试验过程所用的移液枪等仪器设备必须经过确认并在有效期内；玻璃、不锈钢等容器及用具经250℃，至少1h干热灭菌以去除外源性内毒素；塑料器具须经清洗并确证不干扰试验结果；所用的标准品、试剂均在有效期内，鲎试剂初次使用前须进行灵敏度复核。

2.2 细菌内毒素限值L

酒石酸长春瑞滨注射液的细菌内毒素标准CP2010、USP37-NF32中分别为按长春瑞滨计，L<6.0EU/mg（CP2010）与L<3.0IU/mg（USP37-NF32）；EP8.0中酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素标准为L<2.0IU/mg（以长春瑞滨计）。综上所述，本次验证取L<1.0IU/mg（以长春瑞滨计）。

2.3 鲎试剂灵敏度复核

按《中国药典》（2010年版）二部附录ⅪE细菌内毒素检查法“鲎试剂灵敏度复核试验”项下规定进行，所用2批鲎试剂的实测灵敏度λc与标示灵敏度λ均一致（0.5λ≤λc≤2.0λ），均符合规定。

2.4 供试品最低有效活性浓度C计算

当最大有效稀释倍数为1时，相对应的浓度即为最低有效活性浓度（Cp），按Cp=λ/L计算，一般取C>Cp，本次验证C取0.035mg/mL（以长春瑞滨计）。

2.5 干扰试验

2.5.1 供试品溶液（NPC）的制备 精密称取酒石酸长春瑞滨（批号130701）适量，用WBET溶解成含长春瑞滨为10mg/mL的溶液，并用pH调节剂调节pH为6.0～8.0，用WBET稀释制成浓度为C的供试品溶液。

2.5.2 细菌内毒素内毒素工作标准品溶液（PC）和细菌内毒素供试品溶液（（PPC）制备 用1mL WBET将1支内毒素工作标准品溶解后，在旋涡混合器连续混合15min后，分别用WBET和NPC稀释成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的PC和PPC。在进行下一步稀释前，至少混合30s。

2.5.3 干扰试验过程 取鲎试剂1、2各38支，分别用0.1mL WBET溶解，再分别加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ浓度的PC和PPC各0.1mL混和，每一浓度平行做四份。同时用0.1mL WBET平行做2份阴性对照，用0.1mL NPC平行做4份阴性对照。将安瓿中溶液轻轻混匀后封闭管口，垂直放入电热恒温水槽中，从放入开始准确记录时间，在（37±1）℃无振动保温（60±2）min。试验结果见表1。

另取130702、130901批酒石酸长春瑞滨同前操作。试验结果见表2。endprint

从表1、2可见，用两个厂家的鲎试剂对酒石酸长春瑞滨进行干扰试验，结果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此结果表明，酒石酸长春瑞滨对细菌内毒素检查（凝胶法）无干扰的浓度为0.035mg/mL（以长春瑞滨计）。

3 结果

对3批酒石酸长春瑞滨进行细菌内毒素检查，结果均符合规定。见表3。

4 讨论

经试验，酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素限值确定为L<2.0IU/mg（以长春瑞滨计），酒石酸长春瑞滨对细菌内毒素检查（凝胶法）无干扰的浓度为0.035mg/mL（以长春瑞滨计）。

在本试验条件下，取3个批号的供试品，用BET水分别按上述方法配制成0.035mg/mL供试品稀释液，然后用λ=0.03EU/mL的上述两个厂家的鲎试剂各16支实验，供试品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范围之间，确认无干扰影响。酒石酸长春瑞深经过按细菌内毒素检查法实验后，确证了本品可以用稀释方法排除干扰，用细菌内毒素查法（凝胶法）对供试品进行细菌内毒素的检查结果准确可靠。

当细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、供试品的生产工艺或试验环境中发生任何可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。

供试品溶液和鲎试剂混和液的pH值一般在6.0～8.0之间，在检测前应通过加入合适的pH调节剂进行pH调节。

[参考文献]

[1] Okouneva T，Hill BT，Wilson L，et al.The effects of vinflunine vinorelbine，and vinblastine on centromere dynamics[J].Mol Cancer Ther，2003，2（5）：427-436.

[2] Bryan AF，Trailokya NP.Safety and efficacy of vinorelbine in the treatment of non-small cell lung cancer[J].Clin Med Insights On-col，2011，5（10）：131-144.

[3] Gregory RK ，Smith IE.Vinorelbine-a clinical review[J].Br J Cancer，2000，82（12）：1907-1913.

[4] Crawford J.Vinorelbine（navelbine） in non-small cell lung cancer [J].Future directions Lung Cancer，1995，12（3）：311.

[5] Poletti P，Bettini AC，Caremoli ER，et al.Liposomal-encapsulated dox-orubicin（MyocetTM，D-99）and vinorelbine in previously treated metastatic breast cancer patients a feasibility study [J].Tumori，2008，94（5）：686-690.

[6] 许玉华、杜娟、汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：46.

[7] 国家药典委员会编.中国药典（2010年版）二部[S]北京：中国医药科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（欧洲药品质量委员会）编辑，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention编辑出版，2014年5月1日生效.

[12] 中国药品生物制品检定所/中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-389.

（收稿日期：2014-07-22）endprint

从表1、2可见，用两个厂家的鲎试剂对酒石酸长春瑞滨进行干扰试验，结果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此结果表明，酒石酸长春瑞滨对细菌内毒素检查（凝胶法）无干扰的浓度为0.035mg/mL（以长春瑞滨计）。

3 结果

对3批酒石酸长春瑞滨进行细菌内毒素检查，结果均符合规定。见表3。

4 讨论

经试验，酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素限值确定为L<2.0IU/mg（以长春瑞滨计），酒石酸长春瑞滨对细菌内毒素检查（凝胶法）无干扰的浓度为0.035mg/mL（以长春瑞滨计）。

在本试验条件下，取3个批号的供试品，用BET水分别按上述方法配制成0.035mg/mL供试品稀释液，然后用λ=0.03EU/mL的上述两个厂家的鲎试剂各16支实验，供试品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范围之间，确认无干扰影响。酒石酸长春瑞深经过按细菌内毒素检查法实验后，确证了本品可以用稀释方法排除干扰，用细菌内毒素查法（凝胶法）对供试品进行细菌内毒素的检查结果准确可靠。

当细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、供试品的生产工艺或试验环境中发生任何可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。

供试品溶液和鲎试剂混和液的pH值一般在6.0～8.0之间，在检测前应通过加入合适的pH调节剂进行pH调节。

[参考文献]

[1] Okouneva T，Hill BT，Wilson L，et al.The effects of vinflunine vinorelbine，and vinblastine on centromere dynamics[J].Mol Cancer Ther，2003，2（5）：427-436.

[2] Bryan AF，Trailokya NP.Safety and efficacy of vinorelbine in the treatment of non-small cell lung cancer[J].Clin Med Insights On-col，2011，5（10）：131-144.

[3] Gregory RK ，Smith IE.Vinorelbine-a clinical review[J].Br J Cancer，2000，82（12）：1907-1913.

[4] Crawford J.Vinorelbine（navelbine） in non-small cell lung cancer [J].Future directions Lung Cancer，1995，12（3）：311.

[5] Poletti P，Bettini AC，Caremoli ER，et al.Liposomal-encapsulated dox-orubicin（MyocetTM，D-99）and vinorelbine in previously treated metastatic breast cancer patients a feasibility study [J].Tumori，2008，94（5）：686-690.

[6] 许玉华、杜娟、汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：46.

[7] 国家药典委员会编.中国药典（2010年版）二部[S]北京：中国医药科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（欧洲药品质量委员会）编辑，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention编辑出版，2014年5月1日生效.

[12] 中国药品生物制品检定所/中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-389.

（收稿日期：2014-07-22）endprint

从表1、2可见，用两个厂家的鲎试剂对酒石酸长春瑞滨进行干扰试验，结果均符合0.5λ≤ES≤2λ，0.5 Es≤Et≤2.0Es。此结果表明，酒石酸长春瑞滨对细菌内毒素检查（凝胶法）无干扰的浓度为0.035mg/mL（以长春瑞滨计）。

3 结果

对3批酒石酸长春瑞滨进行细菌内毒素检查，结果均符合规定。见表3。

4 讨论

经试验，酒石酸长春瑞滨的细菌内毒素限值确定为L<2.0IU/mg（以长春瑞滨计），酒石酸长春瑞滨对细菌内毒素检查（凝胶法）无干扰的浓度为0.035mg/mL（以长春瑞滨计）。

在本试验条件下，取3个批号的供试品，用BET水分别按上述方法配制成0.035mg/mL供试品稀释液，然后用λ=0.03EU/mL的上述两个厂家的鲎试剂各16支实验，供试品的Et值均在0.5 Es～2.0Es范围之间，确认无干扰影响。酒石酸长春瑞深经过按细菌内毒素检查法实验后，确证了本品可以用稀释方法排除干扰，用细菌内毒素查法（凝胶法）对供试品进行细菌内毒素的检查结果准确可靠。

当细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、供试品的生产工艺或试验环境中发生任何可能影响试验结果的变化时，需重新进行干扰试验。

供试品溶液和鲎试剂混和液的pH值一般在6.0～8.0之间，在检测前应通过加入合适的pH调节剂进行pH调节。

[参考文献]

[1] Okouneva T，Hill BT，Wilson L，et al.The effects of vinflunine vinorelbine，and vinblastine on centromere dynamics[J].Mol Cancer Ther，2003，2（5）：427-436.

[2] Bryan AF，Trailokya NP.Safety and efficacy of vinorelbine in the treatment of non-small cell lung cancer[J].Clin Med Insights On-col，2011，5（10）：131-144.

[3] Gregory RK ，Smith IE.Vinorelbine-a clinical review[J].Br J Cancer，2000，82（12）：1907-1913.

[4] Crawford J.Vinorelbine（navelbine） in non-small cell lung cancer [J].Future directions Lung Cancer，1995，12（3）：311.

[5] Poletti P，Bettini AC，Caremoli ER，et al.Liposomal-encapsulated dox-orubicin（MyocetTM，D-99）and vinorelbine in previously treated metastatic breast cancer patients a feasibility study [J].Tumori，2008，94（5）：686-690.

[6] 许玉华、杜娟、汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：46.

[7] 国家药典委员会编.中国药典（2010年版）二部[S]北京：中国医药科技出版社，2010：1.

[8] USP〈85〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、USP37-NF，32.

[9] EP〈2.1.6.4〉BACTERIAL ENDOTOXIN TEST、EP8.0.

[10] Vinorelbine Tartrate、EP8.0（Page 3205）、EDQM（欧洲药品质量委员会）编辑，2014年1月生效.

[11] Vinorelbine Injection、USP37- NF 32（5158 Vinorelbine/ Official Monographs）、The United States Pharmacopeial Convention编辑出版，2014年5月1日生效.

[12] 中国药品生物制品检定所/中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-389.

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