刘江月

糖尿病大血管病变是糖尿病重要并发症之一，是糖尿病心脑血管疾病的基础，已成为糖尿病致死致残的首要原因，其基本病理变化是动脉粥样硬化。氧化应激在糖尿病血管病变的发生发展过程中起关键作用［1］。梓醇是从地黄块根中提取的小分子环烯醚萜类化合物［2］，具有降血糖、抗肿瘤、保护神经［3-5］等药理学作用。多项研究表明［6-8］，梓醇通过调控凋亡蛋白与清除氧化自由基发挥保护心血管组织的功能。目前，关于梓醇是否能够减轻糖尿病大血管病变，保护大血管国内外尚未见报道。本研究通过高脂饮食诱导Goto-Kakizaki(GK)大鼠主动脉病变模型，从氧化应激角度，以核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)/血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)信号通路为靶点，探讨梓醇对糖尿病损伤主动脉的保护作用及其可能机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物与饲料 清洁级雄性6月龄GK大鼠50只及Wistar大鼠10只，体重(220±20)g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证为SCXK(沪)2012-0002。普通饲料及高脂饲料(83%普通饲料，15%猪油，1.5%胆固醇，0.5%胆盐)由潍坊医学院实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂 梓醇标准品购于上海铭睿科技有限公司，二甲双胍购自北京天安制药股份有限公司，糖化血红蛋白试剂盒购自上海德赛诊断用品有限公司，血脂试剂盒和血糖试纸均购自罗氏生物技术有限公司，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，Nrf2及HO-1抗体均购自Santa Cruz。

1.3 仪器 AU600型全自动生化分析仪，752型紫外分光光度计，DYCZ-25D型电泳仪，Bio-Rad型湿转仪，BiospectrumAC凝胶成像分析系统，H-750透射电子显微镜。

2 方法

2.1 动物模型建立与分组 50只GK大鼠适应性饲养1周，选取随机血糖大于11.1 mmol/L以上45只分为糖尿病模型组(B组)、二甲双胍治疗组(C组，100 mg·kg－1·d－1)以及梓醇高剂量治疗组(D组，100 mg·kg－1·d－1)、中剂量治疗组(E 组，50 mg·kg－1·d－1)、低剂量治疗组(F 组，10 mg·kg－1·d－1)，均高脂饲料喂养。10只健康雄性Wistar大鼠作为对照组(A组)，普通饲料喂养。B、C、D、E和F组均在饮水中加入Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)0.1 g·L－1·d－1进行糖尿病大血管病变造模［9］，造模同时灌胃给药，A、B组给予等量的生理盐水，造模时间12周。

2.2 标本采集及处理 每4周末尾静脉取血测FBG。12周末所有大鼠禁食不禁水过夜，10%水合氯醛3 mL·kg－1腹腔注射麻醉，快速取血15 mL，分离血清，－20℃冰箱保存待测各项血清指标。快速取胸主动脉3段，分别置于10%甲醛溶液、预冷的4%戊二醛溶液及液氮中保存备用。

2.3 血清指标检测 全自动生化分析仪检测总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG);采用化学荧光法检测ROS水平，采用硫代巴比妥酸分光光度法检测MDA和T-AOC水平;采用黄嘌呤氧化酶法间接测定SOD活性;比色法检测糖基化血红蛋白(glycosylated hemoglobin 1c，HbA1c)。

2.4 Western blotting检测Nrf2和HO-1蛋白表达取液氮保存的胸主动脉段，提取总蛋白，SDS-PAGE分离蛋白后将Nrf2和HO-1蛋白转移至NC膜上，分别用Nrf2和HO-1羊抗鼠Ⅰ抗4℃孵育过夜，TBST振荡洗涤3次后，Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST振荡洗涤4次后，ECL发光显色，凝胶成像系统扫描分析。

2.5 组织学检查 取10%甲醛固定的胸主动脉段，石蜡包埋后5 mm切片，HE染色，光镜下观察。

2.6 透射电镜观察 取4%戊二醛固定的胸主动脉段，1%锇酸固定、脱水、包埋，超薄切片后3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察胸主动脉壁组织超微结构变化。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 18.0软件分析，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 梓醇对GK大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)的影响

在实验过程中每4周检测大鼠FBG。结果发现，与A组比较，B组FBG明显升高(P＜0.05);与B组比较，C、D、E各组FBG均明显降低(P＜0.05)，C组与D组降糖效果相当，见图1。

Figure 1.The changes of fasting blood glucose(FBG)in each group.Mean±SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group.图1 各组大鼠FBG变化

2 梓醇对GK大鼠HbA1c和血脂的影响

与A组比较，B组HbA1c明显升高(P＜0.05);与B组比较，C、D、E各组HbA1c均明显降低(P＜0.05);与 E组比较，D组 HbA1c明显降低(P＜0.05)而F组HbA1c明显升高(P＜0.05)，说明梓醇对HbA1c的影响呈明显剂量依赖性，见图2。与A组比较，B组TC和TG明显升高(P＜0.05);与B组比较C、D、E各组TC和TG均明显降低(P＜0.05);与E组比较，D组TC和TG均明显降低(P＜0.05)，而F组TC和TG均明显升高(P＜0.05);与C组比较，D组TC和TG均明显降低，说明梓醇的降脂效果优于二甲双胍且呈明显剂量依赖性，见图3。

3 梓醇对GK大鼠ROS、MDA、T-AOC及SOD的影响

与A组比较，B组血清ROS和MDA含量明显升高(P ＜0.01);与 B 组比较，C、D、E 各组血清 ROS、MDA含量均明显降低(P＜0.01);与C组比较，D组血清ROS和MDA含量均明显降低(P＜0.01);D、E、F各组血清 ROS和 MDA含量差异显著(P＜0.01);与A组比较，B组血清T-AOC和SOD活性明显降低(P＜0.01);与 B组比较，C、D、E 各组血清 TAOC和SOD活性明显升高(P＜0.01);与C组比较，D组血清T-AOC和SOD活性明显升高(P＜0.05，P＜0.01);D、E、F各组血清T-AOC和SOD活性差异显著(P＜0.01)。这些结果说明梓醇具有较强的抗氧化作用，其抗氧化效果优于二甲双胍且呈明显剂量依赖性，见表1。

Figure 2.Comparison of HbA1c in each group.Mean ± SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group.图2 各组大鼠糖化血红蛋白比较

Figure 3.Serum lipid changes in each group.Mean±SD.n=9.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.图3 各组大鼠血脂变化

表1 各组大鼠ROS、MDA、T-AOC及SOD水平Table 1.Levels of ROS，MDA，T-AOC and SOD in each group(Mean ±SD.n=9)

4 梓醇对GK大鼠主动脉组织Nrf2、HO-1蛋白表达的影响

与A组比较，B组大鼠胸主动脉组织Nrf2和HO-1蛋白表达均明显下调(P＜0.05);与B组比较，C、D、E组大鼠胸主动脉组织Nrf2和HO-1蛋白表达均明显上调(P＜0.05);与C组比较，D组Nrf2和HO-1蛋白表达均明显上调(P ＜0.05);D、E、F组Nrf2和HO-1蛋白表达差异显著(P＜0.05)，说明梓醇可通过激活Nrf2/ARE/HO-1信号通路增强组织抗氧化能力，见图4、5。

Figure 4.The expression of Nrf2 protein in thoracic aorta tissue in each group.Mean ± SD.n=3.#P ＜ 0.05 vs A group;*P ＜ 0.05 vs B group;△P ＜ 0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.图4 各组大鼠胸主动脉组织Nrf2蛋白表达

Figure 5.The expression of HO-1 protein in thoracic aorta tissue of each group.Mean ± SD.n=3.#P ＜0.05 vs A group;*P ＜0.05 vs B group;△P ＜0.05 vs E group;▲P ＜0.05 vs C group.图5 各组大鼠胸主动脉组织HO-1蛋白表达

5 梓醇对GK大鼠主动脉组织的形态学影响

光镜下观察到A组大鼠胸主动壁层次清晰，内膜光滑，细胞排列规整;B组可见内膜明显增厚，大量泡沫细胞堆积;C、D、E组内膜增生明显减轻，尤其以C组最为明显，说明梓醇能够保护GK大鼠主动脉，见图6。

Figure 6.Thoracic aorta tissue HE staining(×400).图6 各组大鼠胸主动脉组织HE染色

6 梓醇对GK大鼠主动脉组织超微结构的影响

电镜观察发现A组大鼠胸主动脉内皮细胞形态、结构均正常;B组明显可见空泡大量堆积，细胞损伤明显;C、D、E组损伤明显减轻，尤其以C组最为明显，说明梓醇能够改善GK大鼠主动脉超微结构的改变，见图7。

Figure 7.Ultrastructure of aortic endothelial cells under electron microscope(×2 000).图7 各组大鼠主动脉内皮细胞超微结构

讨 论

大血管病变是糖尿病患者最常见慢性并发症之一，80%糖尿病患者死于大血管病变。研究表明，高血糖、高血脂及氧化应激等诸多因素均参与了糖尿病大血管病变的发生发展［10］。因此，调节糖脂代谢紊乱、减轻或阻断氧化应激是防治糖尿病大血管病变的重要途径。地黄在糖尿病治疗方面具有悠久的历史，是治疗糖尿病最常用的中药之一，梓醇是其主要活性成分，具有降低血糖、保护神经等多种药理学作用。但梓醇对糖尿病大血管病变是否具有保护作用国内外尚未见报道。本研究通过给GK大鼠喂食高脂饮食并在饮水中添加L-NAME，成功复制了糖尿病大血管病变模型［9］。糖尿病大血管病变是血管炎症和氧化应激导致的［11］，研究［12］证实长期应用 LNAME可以诱导早期的血管炎症和动脉粥样硬化，本实验GK大鼠经高脂饮食联合饮水摄入L-NAME 12周，B组大鼠胸主动脉出现糖尿病大血管病变典型特征，符合实验要求。给予梓醇干预治疗，病理学检测显示，GK大鼠胸主动脉病变明显减轻，胸主动脉组织超微结构损伤明显得到改善，表明梓醇能够减轻2型糖尿病大血管病变，对2型糖尿病主动脉具有保护作用。

陈立等［13］发现，梓醇能调节3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢。赵素容等［14］发现，梓醇能显著降低糖尿病大鼠血糖，调节血脂代谢紊乱。本研究也发现梓醇能够显著降低GK大鼠血糖及糖化血红蛋白，改善血脂代谢紊乱，提示梓醇能够降低血糖、调节血脂。

Brownlee［15］曾提出了“糖尿病并发症的统一机制”学说，并指出氧化应激是糖尿病并发症的共同基础。在糖尿病机体内，ROS过量产生，抗氧化酶表达不足，氧化/抗氧化系统失调，ROS不能被及时清除而大量蓄积，从而引起氧化应激反应，造成各系统组织细胞损伤［16-17］。众所周知，ROS和MDA是衡量机体氧化应激水平的主要指标，SOD和T-AOC则是反映机体抗氧化能力的常用指标，因此综合上述指标可以基本判定机体氧化应激水平。本研究发现，糖尿病血管病变模型组大鼠血清ROS和MDA水平明显增高，而SOD活性和T-AOC明显降低，说明氧化应激促进了糖尿病血管病变的发生。Wang等［18］研究发现梓醇能够减轻糖尿病大鼠氧化应激水平。本研究也发现经梓醇治疗后糖尿病大鼠血清ROS和MDA水平显著降低，而SOD活性和T-AOC明显升高，说明梓醇能够降低糖尿病大鼠体内氧化应激水平。

Nrf2是机体氧化应激的感受器，在细胞抗氧化应激中发挥重要作用。在氧化应激状态下，活化的Nrf2与ARE的特异识别位点相结合，上调下游靶分子SOD、HO-1、γ-GCS等抗氧化酶的表达，增强细胞抗氧化能力，抑制氧化应激反应［19-20］。本研究发现，GK大鼠Nrf2蛋白表达明显降低并伴有靶分子HO-1表达下调，经梓醇治疗后Nrf2蛋白表达明显增多并伴有靶分子HO-1表达上调，表明梓醇可激活Nrf2/ARE信号通路，增强抗氧化酶HO-1表达，从而抑制糖尿病氧化应激反应。

综上所述，本研究首次发现梓醇可以减轻糖尿病大血管病变，对糖尿病大血管具有保护作用，这种保护作用与梓醇改善糖尿病糖脂代谢紊乱、激活Nrf2/ARE/HO-1信号通路、减轻糖尿病大血管氧化应激损伤有关。

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